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细胞周期测定实验步骤

发布时间:2022-05-30 10:38:22 阅读:14632次 来源:百度学术

  细胞计数法

  实验方法原理:体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力,可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系,如随着分裂指数的不断提高,细胞也就进入了指数生长期。

  分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比,它是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

  实验步骤:

  一、消化细胞,将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

  二、CO2培养箱中培养48小时,使细胞长在盖片上。

  三、取出盖片,按下列顺序操作:

  PBS漂洗3分钟→甲醇:冰醋酸=3:1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

  四、盖片晾干后反扣在载玻片上,镜检。

  五、计算

  分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

  BrdU参入法

  实验方法原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

  单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。

  BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。

  一、试剂配制

  二、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10 μg/ml。

  三、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1 μg。

  四、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

  五、常规染色体制片。

  六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

  七、弃去2×SSC液,流水冲洗。

  八、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。

  九、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

  十、计算

  细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)

  细胞周期(cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,分为间期与分裂期两个阶段。

  1.间期

  间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。

  (1)G1期

  此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后,分化并执行各自功能,此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段,细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

  (2)S期

  S期是细胞周期的关键时刻,DNA经过复制而含量增加一倍,使体细胞成为4倍体,每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时,还合成组蛋白,进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

  (3)G2期

  为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕,形成两个中心体,还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定,需用1~1.5小时。

  2.分裂期

  细胞的有丝分裂(mitosis)需经前、中、后,末期,是一个连续变化过程,由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1~2小时。

  (1)前期(prophase)染色质丝高度螺旋化,逐渐形成染色体(chromosome)。染色体短而粗,强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动,在细胞中形成两极;而后以中心粒随体为起始点开始合成微管,形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化,核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

  (2)中期(metaphase)细胞变为球形,核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面,从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群,共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46,XY,女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状,均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

  (3)后期(anaphase)由于纺锤体微管的活动,着丝点纵裂,每一染色体的两个染色单体分开,并向相反方向移动,接近各自的中心体,染色单体遂分为两组。与此同时,细胞波拉长,并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动,该部缩窄,细胞遂呈哑铃形。

  (4)末期(telophase)染色单体逐渐解螺旋,重新出现染色质丝与核仁;内质网囊泡组合

  为核被膜;组胞赤道部缩窄加深,最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

  在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类:

  ①增殖细胞群,如造血干细胞,表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力,连续进入细胞周期循环。

  ②不再增殖细胞群,如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞,它们丧失了分裂能力,又称终末细胞(end cell)。

  ③暂不增殖细胞群,如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的,并执行特定功能的细胞,在通常情况下处于G0期,故又称G0期细胞。在某种刺激下,这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后,剩余的肝细胞迅速分裂。

  流式细胞仪

  实验方法原理:流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

  细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。

  实验步骤:

  一、取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,800 rpm,离心15 min去上清。

  二、PBS洗2次,加0.5 mLPBS吹匀,务必吹散。

  三、用5 mL注射器将细胞吸起,用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2周)。

  四、800 rpm 15 min收集固定细胞,PBS洗2次。

  五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)。

  六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ,37℃水浴消化30 min;

  七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。

  八、用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测。

  九、样品分析测定及打印。

  常见问题

  1.Q:胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查,取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查,请问:胃组织要怎样保存好呢?用低温保存,还是用乙醇固定?或者固定后再低温下保存?

  A:以乳腺细胞的DNA含量测定为例,取得组织以后,先处理成单细胞悬液,然后再加70%冰乙醇固定,要保证冰乙醇的最终浓度为50%,这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时,最多可保存一个月,上机检测前再加PI综合染液。保存了将近三个星期,结果还可以,变异系数为5%.

  2.PI分析细胞周期及凋亡率相关问题

  Q:(1)所用的RNAs酶用什么配制呢?用PBS配吗?

  A:RNaseA用PBS配制没有问题,但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

  Q:(2)测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶,可以一起检测吗?

  A:用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定。

  Q:(3)Triton-x-100是固定剂吧,用了70%的冷乙醇(是4℃吗?),是不是就不用Triton-x-100固定了?

  A:Triton X-100是起透化作用的,不是固定剂,可以用75%的乙醇于-20度固定。

  Q:(4)还要设什么内参标准(5%鸡红细胞)吗?

  A:对照肯定是需要的,这个根据自己的需要进行设置。

  3.Q:流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度?

  A:其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见,该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在,常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA,所以为了简便实验操作,也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min,然后加PI 4度孵育30min”。至于染色时使用4度,是因为低温可减弱分子运动,增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。

  4.Q:肿瘤细胞测周期。70%乙醇是否必须用PBS和乙醇配,用水配细胞会碎裂,PBS和乙醇配会出现絮状物?上流式前细胞用75%乙醇固定,使用瓶装75%乙醇是否可行?

  A:先用冷PBS悬浮细胞,大约1-2ml,充分悬浮,使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇,终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是:直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象,很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

  5.Q:流式分析细胞周期,收集了10的6次方细胞,但细胞在乙醇固定之后,还看到有细胞沉淀的,但PBS洗涤两次之后,就基本没什么细胞沉淀了,上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊?怎么解决这个问题啊?

  A:很可能是洗细胞的过程中丢失了,解决办法有:

  (1)尽量采用尖底的离心管和水平离心机

  (2)离心后尽量用吸管吸取上清,不要倾倒;吸上清时最好残留1mm左右的水膜,不要吸完。

  (3)离心的转速或时间可稍微增加一点儿

  (4)每次加抗体时,吸头最好不要接触液面;混匀时最好不要用吸头吹打,以免吸头挂壁带走部分细胞。

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