H22（小鼠肝癌细胞）分离自小鼠腹水，由大连医科学院建立。在实验研究中，常将H22细胞接种于小鼠皮下，建立异位移植模型，广泛用于抗肿瘤药物药效学初步筛选。

　　基础信息

　　生长特性：

　　悬浮细胞

　　细胞形态：

　　淋巴母细胞样

　　生长培养基：

　　RPMI-1640＋10% FBS＋1% P/S

　　推荐传代比例：

　　3×10^5-5×10^5cells/mL

　　推荐换液频率：

　　2~3次/周

　　冻存液：

　　55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO

　　培养条件：

　　气相：空气，95%；CO2，5%

　　温度：37℃

　　腹水传代培养

　　了解完细胞的基础信息，我们就可以着手准备细胞培养了。普诺赛已经为大家总结好了详细的腹水传代步骤，希望能对大家有所帮助!

　　1

　　H22体外培养至合适密度后，离心（1200r/min,3min）收集细胞，用PBS重悬备用；

　　2

　　取0.2mL培养好的细胞计数（细胞密度为1*10^7/mL）后，腹腔注射至小鼠腹腔；

　　3

　　饲养5-6天，小鼠腹水可收集（4-8mL）；

　　4

　　采用无菌抽取或解剖收集腹水后，用PBS稀释2倍后离心（1200r/min,3min），去上清，重复洗涤过程1-2次，加入10mLPBS重悬制备成细胞悬液备用；

　　5

　　取50mL离心管加入10mL小鼠外周血淋巴细胞分离液，上层加入10mL细胞悬液，离心收集沉淀（2000r/min,10min）,重复2-3次；

　　6

　　将收集的沉淀用1640培养基重悬，接种于T175培养瓶中，接种密度为4*10^5 /mL，放置培养箱培养8-12h；

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　　收集细胞悬液离心（1200r/min,3min），用程序冻存液将细胞冻存，冻存密度为10^7/mL。

　　注意事项

　　掌握以上培养步骤就一定可以培养好细胞吗？你还需要掌握以下这些注意事项 ：

　　1

　　新手可以选择处死小鼠，然后先用注射器吸出一些细胞，再剪开腹腔，用枪吸出剩下的；熟练了可以不处死小鼠，直接注射器插进去吸，小鼠还能重复接种；

　　2

　　注意不要戳破内脏，否则容易造成细胞交叉污染；

　　3

　　小鼠饲养时间控制在5天为佳。时间过长，小鼠会死亡或收集的腹水中红细胞含量过高；

　　4

　　复苏之后会有死细胞，但不影响正常腹水的产生；

　　5

　　H22体外培养增殖几代就需要腹水培养一次，否则细胞状态会急速变差，碎片增多。做实验需提前扩增至所需的细胞量然后冻存起来，长期培养需5代内腹水培养一次；

　　6

　　中间每一次传代可以先离心，PBS或生理盐水重悬后打给下一只;

　　7

　　收集腹水红细胞过多时，可以用红细胞裂解液去除；

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　　用分离液分离细胞时，可多次分离筛选，保证细胞的纯度；

　　9

　　冻存细胞最好分离出来后培养8个小时左右再冻存，可以有效去除可能没有筛出去的血红细胞，还可以让细胞的状态调整至最佳；

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　　细胞活力不一样、接种细胞量不一样，腹水长出的时间就不一样。接种是否成功可以通过观察老鼠的状态来确定，接了腹水的老鼠活动力会变弱。

　　常见问题及解答

　　01

　　H22腹水传代可以用哪些小鼠？

　　可以用balb/c小鼠、Km小鼠等，体重在20g左右。

　　02

　　细胞收货有哪些注意事项？

　　到货后，请将细胞瓶竖立着静置2~4h，然后把瓶中培养基上面部分培养基小心吸出，留底部细胞和3mL左右培养基在原瓶。吸出的细胞离心收集细胞沉淀，离心转速1200转3分钟。

　　03

　　为什么刚到货的H22细胞会出现细胞聚团？

　　悬浮细胞发货时密度不能太低，因路上运输，状态不稳定，刚到货时可能会出现聚团的情况。待稳定培养几天，聚团会消失，需要注意培养时少动细胞，以免损伤细胞。