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精准医疗:基因芯片的应用

发布时间:2021-10-14 04:16:01 阅读:15012次 来源:本站

  1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一,足见其在科学史上的意义。现在,基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥( Arabidopsis thaliana )、酵母(Saccharomyces cerevisiae)及人的基因组表达情况进行了研究,并且用该技术(共 157,112 个探针分子)一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异 。实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析,例如对人 BRCA Ⅰ基因外显子11、 CFTR 基因 、β - 地中海贫血 、酵母突变菌株间 、 HIV-1 逆转录酶及蛋白酶基因(与 Sanger 测序结果一致性达到 98% ) 等的突变检测,对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型 ,人线粒体 16.6kb 基因组多态性的研究等。将生物传感器与芯片技术相结合,通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因( ras 等)的单碱基突变 。此外,有人还曾通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。杂交测序是基因芯片技术的另一重要应用。该测序技术理论上不失为一种高效可行的测序方法,但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列,所以需要制作大量的探针。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子,所以它的问世无疑为杂交测序提供了实施的可能性,这已为实践所证实。

  在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径,为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。

  药物筛选和新药开发

  由于所有药物(或兽药)都是直接或间接地通过修饰、改变人类(或相关动物)基因的表达及表达产物的功能而生效,而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况(蛋白质芯片)的能力,在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床,缩短药物筛选所用时间,提高效率,降低风险。

  随着人类基因图谱的绘就,基因工程药物将进入一个大发展时期,在基因工程药物的研制和生产中,生物芯片也有着较大的市场。以基因工程胰岛素为例,当我们把人的胰岛素基因转移到大肠杆菌细胞后,我们就需要用某种方法对工程菌的基因型进行分析,以便确证胰岛素基因是否转移成功。过去人们采取的方法叫做“限制性片段长度多态性”(简称RELP),这种方法非常地烦琐复杂,在成本和效率方面都不如基因芯片,今后被芯片技术取代是必然的趋势。通过使用基因芯片筛选药物具有的巨大优势决定它将成为本世纪药物研究的趋势。

  疾病诊断

  基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术,应用于疾病的诊断,其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速简便;三是可同时检测多种疾病。如应用于产前遗传性疾病检查,抽取少许羊水就可以检测出胎儿是否患有遗传性疾病,同时鉴别的疾病可以达到数十种甚至数百种,这是其他方法所无法替代的,非常有助于“优生优育”这一国策的实施。又如对病原微生物感染诊断,目前的实验室诊断技术所需的时间比较长,检查也不全面,医生往往只能根据临床经验做出诊断,降低了诊断的准确率,如果在检查中应用基因芯片技术,医生在短时间内就能知道病人是哪种病原微生物感染;而且能测定病原体是否产生耐药性、对哪种抗生素产生耐药性、对哪种抗生素敏感等等,这样医生就能有的放矢地制定科学的治疗方案;再如对具有高血压、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接触毒化物质人群恶性肿瘤普查等等,如采用了基因芯片技术,立即就能得到可靠的结果,其他对心血管疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、免疫性疾病、代谢性疾病等,如采用了基因芯片技术,其早期诊断率将大大提高,而误诊率会大大降低,同时有利于医生综合地了解各个系统的疾病状况。

  环境保护

  在环境保护上,基因芯片也广泛的用途,一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害,同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因,制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。

  司法

  基因芯片还可用于司法,现阶段可以通过DNA指纹对比来鉴定罪犯,未来可以建立全国甚至全世界的DNA指纹库,到那时以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析,并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹”进行比较,以尽快、准确的破案。目前,科学家正着手于将生物芯片技术应用于亲子鉴定中,应用生物芯片后,鉴定精度将大幅提高。

  现代农业

  基因芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变,并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因,也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场尚待开发。

  研究领域

  包括基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图以及等方面。

基因芯片应用

  1、基因表达检测。

  人类基因组编码大约10万个不同的基因,仅掌握基因序列信息资料,要理解其基因功能是远远不够的,因此,具有监测大量mRNA(信使RNA,可简单理解为基因表达的中介物)的实验工具很重要。有关对芯片技术检测基因表达及其敏感性、特异性进行的研究实验表明芯片技术易于监测非常大量的mRNAs并能敏感地反映基因表达中的微小变化。利用基因芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究,并且用该技术(共157,112个探针分子)一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。

  2、寻找新基因。

  有关实验表明在缺乏任何序列信息的条件下,基因芯片也可用于基因发现,如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现的。

  3、DNA测序。

  人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展,芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。如使用美国Affymetrix公司1998年生产出的带有13.5万个基因探针的芯片就可以使人类DNA解码速度提高了25倍。

  4、核酸突变的检测及基因组多态性的分析。

  有关实验结果已经表明DNA芯片技术可快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型,人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加,变异与多态性分析必将越来越重要。

  检测原理

  杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法,如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射表面共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等等,但并非每种方法都适用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的结构及性质,需要确定杂交信号在芯片上的位置,尤其是大规模DNA芯片由于其面积小,密度大,点样量很少,所以杂交信号较弱,需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera,CCD)摄像机等弱光信号探测装置。此外,大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度,以确定是完全杂交还是不完全杂交,因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。

  基因芯片

  由于所使用的标记物不同,因而相应的探测方法也各具特色。大多数研究者使用荧光标记物,也有一些研究者使用生物素标记,联合抗生物素结合物检测DNA化学发光。通过检测标记信号来确定DNA芯片杂交谱型。

  荧光标记杂交信号的检测方法

  使用荧光标记物的研究者最多,因而相应的探测方法也就最多、最成熟。由于荧光显微镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物,并具有很好的空间分辨率和热分辨率,特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时,分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率,而在传统的显微镜是很难做到的,这便为DNA芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的基础。大多数方法都是在入射照明式荧光显微镜(epifluoescence microscope)基础上发展起来的,包括激光扫描荧光显微镜、激光共焦扫描显微镜、使用了CCD相机的改进的荧光显微镜以及将DNA芯片直接制作在光纤维束切面上并结合荧光显微镜的光纤传感器微阵列。这些方法基本上都是将待杂交对象 以荧光物质标记,如荧光素或丽丝胶(lissamine)等,杂交后经过SSC和SDS的混合溶液或SSPE等缓冲液清洗。

  激光扫描荧光显微镜

  探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上,并将一物镜置于其上方,由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面,激发荧光标记物产生荧光,光斑半径约为5-10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后,由冷却的光电倍增管探测,经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X-Y方向上步进平移,DNA芯片被逐点照射,所采集荧光信号构成杂交信号谱型,送计算机分析处理,最后形成20μm象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好,适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测,广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。

  激光扫描共焦显微镜

  激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似,但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测,而无须清洗掉未杂交分子,从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S.P.A.Forder等人设计的DNA芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA分子溶液放在样品地中,芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下,与样品池溶液直接接触,并与DNA样品杂交。当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时,既有芯片上杂交的DNA样品所发出的荧光,也有样品地中DNA所发出的荧光,如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。而共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率,可以在接受芯片表面荧光信号的同时,避开样品池中荧光信号的影响。一般采用氩离子激光器(488nm)作为激发光源,经物镜聚焦,从芯片背面入射,聚集于芯片与靶分子溶液接触面。杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集,并经滤波片滤波,被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。经模数转换反转换为数字信号送微机处理,成像分析。在光电信增管前放置一共焦小孔,用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号,避免其对探测结果的影响。激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径,使之能够只照射在单个探针上。通过计算机控制激光束或样品池的移动,便可实现对芯片的二维扫描,移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配,在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高,扫描时间长,比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机,整套系统约 12万美元。

  采用了CCD相机的荧光显微镜

  这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜,但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管,因而无须扫描传动平台。由于不是逐点激发探测,因而激发光照射光场为整个芯片区域,由CCD相机获得整个DNA芯片的杂交谱型。这种方法一般不采用激光器作为激发光源,由于激光束光强的高斯分布,会使得光场光强度分布不均,而荧光信号的强度与激发光的强度密切相关,因而不利于信号采集的线性响应。为保证激发光匀场照射,有的学者使用高压汞灯经滤波片滤波,通过传统的光学物镜将激发光投射到芯片上,照明面积可通过更换物镜来调整;也有的研究者使用大功率弧形探照灯作为光源,使用光纤维束与透镜结合传输激发光,并与芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相机,因而大大提高了获取荧光图像的速度,曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短,灵敏度和分辨率较低,比较适合临床诊断用。

  光纤传感器

  有的研究者将 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上(远端),光纤维束的另一端(近端)经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为200μm,两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交,通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光(490urn),激发荧光标记物产生荧光,仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜,由CCD相机接收。每根光纤单独作用互不干扰,而溶液中的荧光信号基本不会传播到光纤中,杂交到光纤远端的靶分子可在90%的甲酸胺(formamide)和TE缓冲液中浸泡10秒钟去除,进而反复使用。这种方法快速、便捷,可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度,但由于光纤维束所含光纤数目有限,因而不便于制备大规模DNA芯片,有一定的应用局限性。

  生物素标记方法中的杂交信号探测

  以生物素(biotin)标记样品的方法由来已久,通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物(如结合化学发光底物酶、荧光素等),再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号,由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多,因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物,直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制,因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。

  独特优势

  快速、高效、自动化。

  基因芯片不仅能在早期诊断中发挥作用;与传统的检测方法相比,它可以在一张芯片上,同时对多个病人进行多种疾病的检测;利用基因芯片,还可以从分子水平上了解疾病。基因芯片的这些优势,能够使医务人员在短时间内掌握大量的疾病诊断信息,找到正确的治疗措施。除此之外,基因芯片在新药的筛选、临床用药的指导等方面,也有重要作用。

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