磷酸化等于细胞信号传导！

　　细胞如何交流和响应它们的环境信号？自从细胞被发现以来，这个问题就一直是科学家们关注的热点。细胞使用基于生化反应的信号级联来传递或接收信息。多么酷啊？

　　细胞信号的主要秘密是由一群非常有才华的科学家发现的。1  他们发现细胞使用一种称为“蛋白质磷酸化”的过程：将磷酸基团添加到蛋白质的某些氨基酸中，以转导来自细胞外环境的信号。图 1 以肿瘤坏死因子受体信号通路为例说明了细胞信号事件的复杂性。请记住，这只是一个例子——细胞表面有数百个受体！

　　那么，磷酸化是如何在细胞信号传导中发挥作用的呢？磷酸化参与某些蛋白质的活化或失活。在我们身体使用的 20 种氨基酸中，有 3 种氨基酸可以被磷酸化用于信号转导途径。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸都具有可用于磷酸化的羟基 (OH-) 侧基。

　　今天，我要告诉你为什么在细胞信号分析方面，你应该把旧的值得信赖的蛋白质印迹放在一边，尝试多参数流式细胞术。

　　图 1. 示意性细胞信号通路。源文件：Wikicommons，Subclavian

　　您如何检测蛋白质磷酸化？

　　检测蛋白磷酸化的方法有很多，均使用单克隆抗体检测磷酸化蛋白。然而，不同的方法具有不同程度的分辨率和实验速度。

　　例如，您可以运行蛋白质印迹分析来区分磷酸化和非磷酸化蛋白质。这种方法需要两个单独的印迹：一个印迹检测蛋白质的总量，第二个只检测蛋白质的活化或磷酸化形式。这需要更多的样本，这可能是有限的。在进行蛋白质印迹之前，您可能需要进行免疫共沉淀以丰富细胞群。

　　蛋白质印迹的另一个缺点是批量分析。批量分析不会告诉您正在经历细胞信号传导的特定细胞群是否发生变化，除非您设法获得 100% 纯细胞群。因此，有时检测信号蛋白的激活是困难的。但是有一个更好的解决方案。流式细胞仪可助您一臂之力！

　　用于细胞信号传导的多颜色、多参数流式细胞术

　　与其他方法不同，流式细胞术在单个细胞水平上提供高分辨率。流式细胞仪记录多个参数（取决于机器的容量和可用的抗体标记的数量）。当您分析您的结果时，您不仅会发现您的激活群体中是否存在阳性条带，而未处理组中是否存在阴性条带，就像在蛋白质印迹中那样。您可以精确定位哪些细胞被激活，或者是否有多个途径被激活。

　　磷流

　　流式细胞仪的一项很酷的事情是，您不仅可以用抗体染色表面分子，还可以使用细胞内染色方案检测细胞内的蛋白质。在 phosphoflow 中，首先用特定受体的配体刺激外周血单核细胞 (PBMC) 或其他细胞群。然后，使用多聚甲醛固定细胞以保持细胞内蛋白质的状态。去污剂透化细胞膜，使荧光标记的抗体进入细胞并与磷酸化蛋白结合。

　　为什么 Phosphoflow 在您的研究中具有优势？

　　Phosphoflow 允许您同时研究多种活化蛋白。例如，您可以检查癌细胞与健康肺细胞的差异，并在一个环境中运行两种细胞类型。3在一个设置中运行单元有助于提高效率并最大限度地减少实验变量。此外，磷酸流的多重性质意味着您可以使用流式细胞仪寻找不同的活化激酶。5

　　此外，如果您使用具有高通量系统的流式细胞仪4，您可以在药物发现中使用 phosphoflow 来筛选增强或抑制某些信号通路的化合物。因此，继续尝试 phosphoflow 并亲自看看。

　　我们的细胞通过细胞表面的受体传递许多不同的信号，通过使用磷酸化作为标志（信号）的中间信号级联，最终导致不同基因的激活以实现生存。我提供了传统蛋白质印迹和磷酸化流之间的一些优缺点。如果您只对检测细胞信号级联中的少数磷酸化蛋白感兴趣，那么蛋白质印迹肯定会成功。但是，如果您面临包含许多不同细胞群的样本，流式细胞术是更好的工具。顺其自然！