流式细胞仪。有些人喜欢它——大多数人讨厌它——但所有人都同意它是免疫学家拥有的最强大的分析工具之一。这里有一个快速复习：顾名思义，流式细胞仪测量细胞的物理和化学特性。这是通过使用与荧光团结合的抗体对细胞表面标记/蛋白质进行荧光标记来实现的。然后当细胞通过一系列激光时发射的荧光波长和产生的光散射图案都被测量。可以分析这些数据以提供有关细胞大小、粒度、表型和功能的信息。

　　既然我们在同一页上，那么您如何达到拥有可解释数据的地步？也就是说，一旦您的样本通过您选择的机器（BD Fortessa、BD LSRII 等），您如何才能将您感兴趣的细胞与异质群体中的所有其他（在您看来）非必需细胞区分开来？

　　欢迎来到门控的精彩世界——也被称为流式细胞术中最令人沮丧的部分！不是真的，但很多人这么认为，主要是因为它的主观性。无论如何，门控是分析流式细胞仪数据的最重要部分。如果操作不正确，您可以在分析中包含不属于的单元格，也可以排除重要的单元格。无论哪种方式，您都可以在脚上开枪。不过没有压力。

　　那么究竟什么是门控呢？根据 FlowJo（我们大多数免疫学家的首选流式细胞术分析程序），门控是指“选择收集的事件子集进行进一步分析的过程”。更简单地说，当您将原始数据文件打开到 FlowJo 工作区并打开一个窗口时，绘制的每个小点都代表一个单元格，在 FlowJo 中是一个“收集的事件”。通过绘制形状或设置象限（又名门控）将这些收集到的事件分成特定的群体，您可以开始创建细胞子集，直到达到您对研究感兴趣的群体。很酷，不是吗？

　　我如何制作门？

　　FlowJo 中存在几个门控工具来帮助对绘图进行门控，包括矩形、椭圆和象限（图 1）。如果这些工具都不能满足您的需求，您始终可以使用多边形工具围绕感兴趣的人群制作自己的形状。

图 1. 门控工具示例。由FlowJo提供

　　快速提示：使用多边形工具时，无需拿出放大镜来匹配起点和终点，只需双击终点——线条会自动找到起点并完成形状。

　　在检查直方图的情况下，您可以使用范围工具。一旦设置了这些门，FlowJo 将为您提供命名刚刚隔离的人口的选项。我强烈建议重命名它 - 否则 FlowJo 将默认根据您在窗口中比较的荧光标记来命名种群，并且名称可能会变得非常冗长和繁琐。

　　我在哪里放置我的门？

　　门控中非常重要的一点是了解正荧光和负荧光在图上的位置。流式细胞术中广泛使用两种染色对照：同种型和 FMO。

　　虽然同种型对照在任何情况下都不应被视为实际对照（能够区分阳性和阴性群体），但它们对于确定您正在使用的一抗的非特异性结合水平非常重要。

　　更重要的是FMO或荧光减一的概念。另一篇文章更详细地介绍了 FMO，但简而言之，FMO 允许您确定多色面板中的荧光团如何相互作用并影响彼此的传播（图 2）。因此，FMO 对于正确识别地块中的阳性和阴性种群至关重要。

　　图 2. FMO 示例。由飞镖实验室提供。

　　一旦您确定了荧光团的正边界和负边界的位置，分离样本中的种群应该非常简单。在下面的示例中，如果您试图区分 CD3+ 和 CD3- 细胞，您只需围绕您感兴趣的任何群体画一个门（图 3A）。在这种情况下，您正在考虑比较两个细胞表面标记，例如 CD3 和 NKG2D，您可能决定使用象限工具来分离所有 4 个群体子集，或者使用矩形来挑选出一个分组（图 3B）。这完全取决于您和您正在学习的内容。因此，您必须在开始分析之前想出一个门控策略，否则您可能会迷失在森林中。门控策略只是基于您感兴趣的细胞的表型。例如，我的目标可能是观察 CD45+ 细胞，它们是单峰（相对于双峰，这意味着两个细胞同时通过激光前）和活的（相对于死的）。因此，对于这种情况，我将在那些单线细胞周围设置门，然后从这个群体中分离出那些单线和活的细胞，然后从那个子集中，我将对那些也是 CD45+ 的细胞进行门控。十分简单。

　　图 3. 使用流式细胞仪描绘免疫细胞群。A. CD3 阳性和阴性人群。B. 比较表达不同水平 CD3 和 NKG2D 的细胞群。

　　为什么这看起来仍然如此困难？

　　简单明了：主观性。由于细胞的可塑性、它们对条件和处理的反应、使用的荧光标记物的类型、用于采集样本的 PMT 电压以及许多其他参数，因此没有可以可靠地应用于所有数据的设置门控位置。的时间。因此，即使您在样本和后续分析中尽可能地保持一致，您仍可能会看到绘图中总体布局的可变性。虽然您可以控制这种不连续性的许多方面，但在决定门的最终位置时，很多时候您必须凭直觉行事。说起来容易做起来难，考虑到我们人类对数据分析的自然偏见。但请放心：熟能生巧。因此，您对流式细胞术越熟悉，您越容易为感兴趣的人群确定正确的门边界。我保证。