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3 种最常见的流式细胞术谬误(流式细胞术常见问题)

发布时间:2022-04-26 10:26:07 阅读:14702次 来源:百度学术

  流式细胞术正在快速发展,从仅受免疫学家推崇的方法发展为几乎所有生物学专业都使用的方法。这几乎是我最喜欢的工具。不幸的是,与大多数实验室技术一样,大部分流式细胞术都是在工作中教授的,没有很多标准。很多时候,坏习惯就像福音一样传播,而实际上它们是谬误。

  但是你可以避免上那辆火车!以下是流式细胞仪最常见的 3 个新手错误。

  3 常见的流式细胞术谬误

  1. 相信同型对照是“真正的”对照

  首先,让我们齐心协力。流式细胞术依赖于与针对特定抗原的抗体偶联的荧光团的检测。抗体(或免疫球蛋白)由两条免疫球蛋白重链和两条轻链形成。在免疫学中,抗体同种型是指变体免疫球蛋白重链和轻链。在人类中,有五种重链同种型和两种轻链同种型。

  那么……免疫学底漆是怎么回事?好吧,当细胞由于膜完整性受损而开始死亡时,抗体总是有可能与低亲和力、非特异性靶标或细胞内靶标非特异性结合。因此,为了确保我们的数据可靠,我们需要考虑这种非特异性结合。一种方法是使用同型对照。这些对照抗体与测定中使用的抗体具有相同的同种型,但不针对特定蛋白质。例如,如果我们选择在测定中使用具有 IgG1, kappa 同种型的抗 CD3 FITC 抗体,我们将选择具有 IgG1, kappa 同种型的 FITC 抗体作为同种型对照。

  很明显,同型对照有其位置和目的。问题是当人们使用同种型对照作为实际测定对照时,或使用它来区分阳性和阴性群体。同型对照真正做的是确定非特异性结合,以及您的细胞在染色前是否没有被正确封闭。因此,请不要在您的实验中使用它们代替真正的对照(即未染色的细胞、未刺激的细胞等)。

  2. 不运行控件/FMO

  任何一位优秀的科学家都知道,为您的实验设置适当的控制是获得可靠数据的关键。因此,您绝对必须毫无疑问地使用您的实验流式细胞仪样本运行对照样本。如果您碰巧正在查看激活,它们可以像未染色或未刺激的细胞一样简单。但是,您必须有实际的阴性对照来比较您的数据——在您询问之前,不,您不能与您的阴性补偿对照进行比较。

  在运行控制样本中同样重要的是另一种控制方式,可悲的是,它经常被忽视,特别是对于流式细胞术的新手:FMO。

  FMO,或荧光减一,是一个具有巨大影响的基本概念。快速提醒:在流式细胞术中使用荧光分子意味着我们需要关注最小化光谱重叠和数据扩散,这两个问题是不可避免但可以解决的。第一个是通过补偿过程解决的,后者是通过运行 FMO 来解决的。

  作为一个运行了太多 FMO 面板的人,他们很痛苦。说真的,他们是最糟糕的。但是,当与控制对流式细胞术实验的重要性相平衡时,很容易有动力花时间执行它们,并很好地执行它们。

  3. 执行手动补偿

  如上所述,补偿是校正荧光溢出的过程。幸运的是,大多数用于捕获原始流式细胞仪数据的软件(即FACS Diva)也可以计算并制作补偿矩阵,而无需用户动动手指。尽管如此,许多研究人员仍然认为需要手动补偿,通常仅基于流程图美学。这是一个非常糟糕的主意。

  您会看到,有一些特定的算法可以根据您提供的仪器信息(即补偿控制和实验设置)1计算补偿。因此,如果您决定使用这些数字,您将面临获取不正确数据的风险。但是,如果您花时间尽可能完美地设置您的实验,您可以避免人工补偿数据的下意识反应。你最终会为自己省去一个大麻烦。

  最后一点,如果您在上述几点或流式细胞仪的任何其他方面遇到任何困难,您可能会发现您所在机构的流式细胞仪核心是一个很好的来源。那些人是合法的。


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