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大肠杆菌转化实验(热击法)-大肠杆菌转化实验操作步骤

2022-04-21 10:18:35
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  大肠杆菌转化可以:(1)将重组 DNA 分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。

  大肠杆菌转化实验原理

  质粒 DNA 粘附在细菌细胞表面,经过 42°C 短时间的热击处理,促进吸收 DNA。然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。

  器材和试剂

  旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体 LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。

  质粒 DNA,重组 DNA,培养基(不加抗菌素),LB 培养基(加抗菌素),无菌 ddH2O,IPTG,X-gal。

  大肠杆菌转化实验实验准备

  无菌 ddH2O,1.5ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用 N,N-二甲基甲酰胺配)。

  大肠杆菌转化实验操作步骤

  (1)事先将恒温水浴的温度调到 42℃。

  (2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴 5~10min。

  (3) 加入 5μl 连接好的质粒混合液(DNA 含量不超过 100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。

  (4)轻轻摇匀后插入 42℃水浴中 1~2min 进行热休克,然后迅速放回冰中,静置 3~5min。

  (5) 在超净工作台中向上述各管中分别加入 500μl LB 培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上 37℃震荡 1h。

  (6) 在超净工作台中取上述转化混合液 100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体 LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。

  (7)如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加 40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

  (8) 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在 37℃恒温培养箱中 30-60min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入 37℃恒温培养箱过夜。

  (9) 在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。

  (10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

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