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蛋白质染色方法:3 种最佳方法概述

发布时间:2022-04-20 10:25:02 阅读:121612次 来源:百度学术

  在SDS-PAGE或2 维电泳之后对蛋白质进行染色对于可视化整体蛋白质群或检查重组蛋白质的表达是必要的。

  但是你怎么知道使用哪种蛋白质染色方法呢?

  本文解释了三种最常见的蛋白质染色方法的优缺点:银染、考马斯亮蓝染色和 InstantBlue ™染色。

  1. 银渍

  需要无需下游应用的高灵敏度染色剂?银色染色可能正是您所需要的。

  它是如何工作的?

  银染色利用蛋白质的银阳离子 (Ag 1+ ) 结合能力。银阳离子与靶蛋白结合,随后使用显影液还原为金属银。这将创建一个可见的图像。

  优点和缺点

  银染的主要好处是它的高灵敏度(见下文)。然而,银染涉及多个步骤和试剂,使得该过程相对耗时且费力。

  此外,凝胶需要在染色后进行显影,以使蛋白质可视化,并且显影所需的时间长度在凝胶之间存在很大差异。其结果是再现性低。

  银染的另一个缺点是在固定凝胶时使用甲醛使银染与质谱法不兼容。确实存在与质谱法兼容但以牺牲灵敏度为代价的银染色方案。

  银染色还具有狭窄的线性动态范围(染色水平与蛋白质浓度成正比的范围),使其不太适合量化。

  近似检测限

  银染色可以检测到约 1 ng 的蛋白质 [1],这使得它对于涉及低蛋白质水平的应用非常有用。

  研究人员的意见

  银染是我最不喜欢的蛋白质染色方法,不仅因为需要多个步骤,还因为使用了几种危险的化学物质(包括硝酸银和甲醛),我希望尽可能避免这些化学物质。(根据我的经验)去除长凳和设备上的银渍也非常困难——所以要小心!

  如果您想了解有关不同银蛋白染色方法的更多信息和协议,包括用于质谱的方法,请查看 Chevallet等 人的这篇论文。[2]

  2.考马斯亮蓝

  考马斯染色可能是最著名的蛋白质染色技术。存在两种主要类型的考马斯染色:

  原始或“经典”考马斯;

  较新的胶体考马斯。

  让我们按顺序讨论它们。

  古典考马斯

  需要一种可以与您的实验室团队分享的可靠的黄油蛋白质染色方法吗?经典的考马斯蛋白染色是前进的方向。

  它是如何工作的?

  经典的考马斯蛋白染色技术包括将凝胶与考马斯染色溶液一起孵育。这会染色整个凝胶,而不仅仅是蛋白质。随后通过在 10% 乙酸、50% 甲醇和 40% H 2 O 的溶液中搅拌凝胶来去除染色剂。这个过程称为脱色。

  由于蛋白质分子比多孔凝胶基质更好地保留染料,因此蛋白质条带变得可见。

  优点和缺点

  经典的考马斯蛋白染色方法既便宜又容易,但比银染色灵敏度低得多,这使得低丰度蛋白质的可视化变得困难。由于难以标准化脱色步骤,经典考马斯染色的低重现性也是一个缺点。

  考马斯染色的一大优点是它与质谱法兼容。

  近似检测限

  经典考马斯的检测下限约为 100 ng。[1]

  研究人员的意见

  这种蛋白质染色方法是我个人最喜欢的简单任务,例如重组蛋白质的可视化或生成的抗体,因为它执行起来简单快捷。这使得它非常适合日常使用。

  胶体考马斯

  胶体考马斯蛋白染色在经典考马斯染色和银染之间提供了一种令人满意的介质,具有相对较高的灵敏度并且操作简单。它还与蛋白质质谱法兼容。

  它是如何工作的?

  该方法是对经典考马斯染色的改编,该染色使用改良的考马斯染料(G-250 而不是 R-250)。想找个找茬游戏吗?G-250和R-250的结构如下图1所示。

  因为胶体染料不会渗透凝胶,所以不需要脱色。然而,可以进行脱色以增加蛋白质条带和背景之间的对比度。

  优点和缺点

  胶体考马斯与经典考马斯蛋白染色相比有几个优点。由于缺少脱色步骤,这些包括比银和经典考马斯染色更高的灵敏度和更高的重现性。

  然而,所有美好的事物都是有代价的,胶体考马斯套件会比您的常规考马斯染色花费更多。

  许多使用胶体考马斯进行蛋白质染色的协议是可用的,其中一些协议由 Dyballa 和 Metzger 在本文中进行了描述和比较。[3]

  近似检测限

  胶体考马斯的检测限约为 10 ng,使其比经典考马斯灵敏约一个数量级。

  研究人员的意见

  这种蛋白质染色方法比经典考马斯法更高的灵敏度使其非常适合涉及低蛋白质水平的实验,例如分析 co-IP 中的结合蛋白,尤其是当您考虑使用质谱法量化蛋白质条带时。

蛋白质染色方法:3 种最佳方法概述

  图 1。考马斯(G-250)和胶体考马斯(R-250)的结构。(图片来源:托马斯·沃里克。)

  3. InstantBlue™

  匆匆?或者根本就不能被所有那些染色和脱色的马拉奇所困扰?谢天谢地InstantBlue ™。

  它是另一种基于考马斯的蛋白质染色剂,但其配方可提供蛋白质的一步可视化。

  它是如何工作的?

  我很想能够告诉你这种蛋白质染色方法是如何工作的,但是那个大的注册商标符号意味着有一点信息真空。

  用户手动神秘地声明“InstantBlue 在水中含有考马斯 [原文如此] 染料、乙醇、磷酸和增溶剂”。

  鉴于不需要脱色,它的作用必须类似于胶体考马斯,并专门染色蛋白质分子而不是凝胶。

  优点和缺点

  InstantBlue™ 蛋白质染色剂作用迅速。非常快。您将在 10-15 分钟内看到您的蛋白质条带。作为一步程序,它也快速且可重复。与其他基于考马斯的染料一样,它与质谱法完全兼容。

  然而,它是感光的,并且会随着时间的推移而退化。您可以重复使用它,但将重复使用的物质虹吸到单独的不透明容器中,当您发现它不再染色您的蛋白质时将其丢弃。

  近似检测限

  InstantBlue™ 蛋白质染料可以检测低至约 5 ng 的蛋白质。如果您难以看到微弱的蛋白质条带,请将已显影的凝胶浸泡在水中以增加它们的对比度。

  研究人员的意见

  当我为X 射线晶体学纯化蛋白质时,我没有时间等待凝胶脱色,然后才能确定我确实表达了我的目标。这就是我使用 InstantBlue™ 蛋白质染色方法的原因。唯一的问题是其他实验室用户窃取了它,所以请保留您自己的秘密藏匿处。

  讨论的蛋白质染色方法回顾

  如果它不是信息密集的,那将不是一篇好文章!这是上面介绍的不同蛋白质染色方法的摘要。

  表 1。银、考马斯、胶体考马斯和 InstantBlue™ 染料的总结。

表 1。银、考马斯、胶体考马斯和 InstantBlue™ 染料的总结。

  希望您现在掌握了足够的信息来选择最适合您预期实验的蛋白质染色方法。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1063.html

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