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总RNA提取:获得高纯度RNA的简单方法

发布时间:2022-04-19 10:38:14 阅读:110242次 来源:百度学术

  虽然 DNA 可以存活数千年,但 RNA 的寿命很短,这会使总 RNA 的提取变得棘手,因为 RNA 容易被称为 RNases 的酶降解,这种酶无处不在。

  因此,从细胞和组织中分离总 RNA 需要一种能够有效地从样品中分离 RNA,同时最大限度地减少 RNA 降解的方法。

  什么是总RNA?

  如您所料,总 RNA 是在细胞内发现的所有 RNA 分子。这包括:

  信使 RNA (mRNA):长蛋白质编码信使 RNA 转录本,可作为特定条件下细胞基因表达的瞬时读数

  MicroRNA (miRNA):无数其他较小的非编码 RNA 分子,其中许多参与调节和沉默基因表达。

  核糖体 RNA (rRNA):核糖体的关键成分,对蛋白质合成至关重要。

  转移 RNA (tRNA):蛋白质合成的另一个关键成分。这些 RNA 分子将氨基酸转运到核糖体并与 mRNA 进行碱基配对,以确保将正确的氨基酸添加到正在合成的蛋白质中。

  什么是核糖核酸酶?

  核糖核酸酶 (RNase) 是降解 RNA 的酶。这些酶在分离或处理 RNA 时会产生很大的问题,因为RNase 无处不在(随处可见)、难以消除且极具破坏性。因此,在提取总 RNA 时,您需要确保您的工作是无RNA 的。

  使用 TRIzol® 分离总 RNA,减去 RNase

  幸运的是,有一些方法可以使 RNase 失活并防止您珍贵的 RNA 样本被破坏。一种提取 RNA 同时还抑制 RNases 的方法是硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法,首先由Piotr Chomczynski 和 Nicoletta Sacchi应用于 RNA 提取。

  TRIzol® 是苯酚和异硫氰酸胍的单相混合物,通常用于 RNA 提取,是一种强大的蛋白质变性剂,可分解蛋白质细胞成分并使所有酶(包括 RNase)失活。

  TRIzol 提取通常使用酸性苯酚-氯仿将总 RNA 限制在透明的水相中,而蛋白质和细胞碎片最终会留在粉红色的有机层中。RNA 可以通过用异丙醇沉淀、洗涤然后重新溶解在水中来回收。TRIzol 是一个品牌名称,许多其他供应商提供他们自己的版本,包括:

  RNAzol®

  QIAzol

  TriPure™

  也可以制作自己的苯酚和异硫氰酸胍混合物。

  使用 TRIzol 从细胞和组织中提取总 RNA 的方案

  1. 细胞裂解

  如果您从组织中分离 RNA,您需要先使用匀浆器在每 50 至 100 mg 组织中加入 1 ml TRIzol 试剂匀浆样品。样品体积不应超过 TRIzol 体积的 10%。

  如果您要从培养的贴壁细胞中分离 RNA,请用冰冷的 PBS 冲洗细胞,然后在培养皿或烧瓶中直接裂解细胞,方法是每 10 cm² 面积加入 1 ml TRIzol 试剂,然后用细胞刮刀或移液器吸头刮擦。

  将细胞裂解液通过吸管并彻底涡旋数次。如果您的培养物由悬浮细胞组成,请向下旋转细胞以去除旧培养基,然后用 1 ml TRIZOL 在 PBS 裂解细胞中通过上下吹打数次来清洗多达 1000 万个细胞。

  2. 孵化和苯酚-氯仿分离

  将匀浆样品在室温下孵育 5 分钟以解离核蛋白复合物。

  每 1 体积的 TRIzol 试剂添加 0.2 体积的氯仿。盖紧试管并用力涡旋样品 15 秒。

  在室温下孵育样品 5 分钟。

  在 4°C 下以不超过 12,000 xg 的速度将样品离心 15 分钟。混合物将分成三个阶段(图 1)。

  较低的有机相。

  相间。

  含有 RNA 的上层水相。

使用 TRIzol 提取总 RNA。

  图 1.苯酚-氯仿分离为 (1) 有机相、(2) 中间相和 (3) 水相。(图片:劳拉·格拉西)

  3. RNA 沉淀

  小心地将上层水相转移到新管中,不要干扰界面。水相的体积通常约为步骤 1 中使用的 TRIzol 体积的 60%。

  每 1 ml TRIZOL 使用 0.5 ml 异丙醇从水相中沉淀 RNA。

  将样品在室温下孵育 10 分钟,然后在 4°C 下以不超过 12,000 xg 的速度离心 10 分钟。RNA 沉淀会在试管的侧面或底部形成颗粒,肉眼很难看到。

  4. RNA 洗涤和再悬浮

  去除上清液并用 75% 乙醇清洗一次 RNA 沉淀。

  通过涡旋混合样品并在 4°C 下以不超过 8000 xg 的速度离心 5 分钟。重复上述洗涤程序并除去所有剩余的乙醇。

  风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟,但不要在真空下加热或离心。此外,避免过度干燥 RNA,否则将难以重新溶解沉淀。

  将溶液通过移液器吸头几次,将 RNA 溶解在 DEPC 处理过的水中。

  5. 确定 RNA 浓度和纯度

  重新溶解样品后,通过在 260 nm 和 280 nm 处进行 OD 测量来确定样品浓度和纯度。A260/A280 比率应在 1.6 以上。

  TRIzol 对总 RNA 提取的好处

  TRIzol 对总 RNA 提取有很多好处,包括:

  RNase 的变性。

  提取总 RNA,包括 miRNA 等小分子量 RNA。

  高质量的 RNA。

  使用比较简单。

  允许从样品中同时提取 DNA、蛋白质和 RNA。

  使用 TRIzol 的缺点

  TRIzol 在总 RNA 提取中的使用存在一些局限性。

  与其他传统的 RNA 提取方法相比,该试剂成本较高。

  使用危险和有害的化学品。

  去除水层时,提取的 RNA 可能会被苯酚和其他污染物污染。

  执行起来可能很耗时,并且学习曲线陡峭。

  用于 RNA 提取的 TRIzol 的替代方法

  TRIzol 总 RNA 提取的危险性和陡峭的学习曲线导致市场需要更安全、更简单的 RNA 提取替代品,这些替代品仍能提供高质量的 RNA。

  RNA 提取试剂盒

  许多不使用 TRIzol 或其他危险化学品的商业套件可用。这些使用旋转柱或磁珠来捕获然后可以被洗脱的 RNA。但是,它们可能并不适合所有应用,因此请在购买前查看用户手册以检查该套件:

  适用于您的样品类型。

  分离您感兴趣的 RNA。

  如果您要从专业组织样本(例如血液、纤维组织、植物组织)中提取 DNA,请检查是否有可用的试剂盒。制造商已经创建和优化了从一系列组织和源材料中提取 RNA 的试剂盒。

  如果您正在寻找分析 miRNA 或其他小分子量 RNA 种类,请注意。许多 RNA 分离试剂盒,尤其是那些使用离心柱的试剂盒,可能无法成功分离这些小分子。但是,可以使用专为 miRNA 和其他小 RNA 分子设计的定制试剂盒。

  提供 RNA 提取试剂盒的公司包括:

  凯根

  赛默飞世尔科技

  SigmaAldrich

  Zymo研究

  普罗米加

  安捷伦科技

  罗氏

  虽然 RNA 提取试剂盒提供了一种方便的替代方案,但它们可能很昂贵,如果您从各种组织中分离 RNA,您可能需要多个试剂盒。

  有些试剂盒可以与 TRIzol 提取结合使用,方法是在沉淀步骤之后捕获 RNA,从而使后续的洗涤和洗脱更容易和更快。如果您已经将样本存储在 TRIzol 中,这可能是一个选项。

  总 RNA 提取的老派方法

  如果您不想使用商业试剂盒,但仍想避免 TRIzol(和替代品)的成本,请考虑回到老派的总 RNA 提取方法。

  下面我们分享一种从Vicki Doronina的酵母(也可用于其他来源)中提取总 RNA 的无 TRIzol 方法。请注意,此方法仍然使用危险化学品,因此在使用前可以仔细考虑。

  该总 RNA 提取方案使用苯酚和一些盐的混合物。所需要的只是一些 Tris、SDS 和苯酚-氯仿混合物。Vicki 从未在非酵母细胞上使用过该方案,但她几乎可以肯定,在 RNA 缓冲液中的均质化步骤之后,它可以应用于任何细胞类型。将缓冲液的 pH 从中性更改为酸性(pH 4.5)也可以分离氨酰化 tRNA。

  苯酚-氯仿 RNA 提取方案

  1. 培养 25–100 ml 细胞至 OD 600 = 0.25–0.5(您甚至不需要分光光度计)。

  2. 旋转细胞,在 1 mL dH 2 O 中清洗,然后转移到螺旋盖管中。您可以在此阶段快速冷冻颗粒。

  3. 向 1 体积冷 RNA 缓冲液中加入 SDS 至终浓度 0.5%(1/40 体积 20% SDS)。

  4. 在 200 µl 冷 SDS/RNA 缓冲液中重悬冷冻沉淀。

  5、加入1体积苯酚-氯仿;填充珠子以达到上述溶液。

  6. 破开(通常是 30 秒/冰上 1 分钟/最大 Ribolyser 设置下 30 秒),但您的常规破开程序可能同样有效。

  7. 用 RNA 缓冲液(未添加 SDS)填充试管,涡旋,并保持冷却旋转 5 分钟。

  8. 您将在试管底部看到苯酚-氯仿部分、白色碎屑层和顶部缓冲液水平。取顶层并转移到新鲜的无 RNase Eppendorf。

  9. 用苯酚-氯仿萃取水相两次,振摇 5 分钟。加入 0.9–1 体积的异丙醇,混合并在室温下旋转 15–20 分钟。由于缓冲液中含有大量盐分,因此无需额外添加乙酸钠

  (如果意外添加了 1/10 3M 乙酸钠,将干燥的沉淀溶解在 600 µl RNA 缓冲液中,摇动孵育 5 分钟,加入 600 µl 异丙醇,旋转 10-5 分钟,以去除盐分。之后至步骤 9)。

  10. 用 70% 洗涤沉淀,风干,重悬于 30-50 µl dH 2 O 或 TE 中,测量 OD260/280 比率。

  RNA 缓冲液(50 毫升)

  100 mM EDTA pH 8.0(10 mL 0.5M 库存)

  100 mM NaCl(1 mL 5M 库存)

  50 mM Tris-HCl pH 8.0(2.5 mL 1M 库存)

  36.5 毫升 dH 2 O

  总 RNA 提取总结

  有许多方法可用于从一系列样品中提取总 RNA,从“黄金标准”TRIzol 到市售的离心试剂盒和老式苯酚-氯仿提取。每种 RNA 分离方法都有其成本、危险化学品的使用和适用性的优缺点,在选择之前应仔细考虑每一种方法。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1062.html

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