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怎么去确认RNA的质量,测RNA浓度、纯度和完整性的方式

2022-07-29 10:23:02
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  实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。RNA样本提取的质量直接影响基因表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种:RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。

  检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种:

  紫外分光光度计法:

  测量260nm吸收值计算RNA浓度,测量260nm/280nm吸收值的比值,用于评估RNA纯度。需要注意的是:在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。

  260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。<1.9,说明有蛋白质残留;>2.1,说明RNA可能发生降解。

  琼脂糖凝胶电泳:

  完整的RNA通常有三条带,最亮的是28S条带,其次是18S条带,最淡的是5S条带(部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带)。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。

  如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利,28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量最好。

  若RNA条带出现弥散,原因可能:RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。


  上述两种方法在实验室比较常用,此外还有几种检测方式供大家选择。

  荧光染料检测:

  通过荧光染料和RNA结合,荧光活性增强。此方法的灵敏度较高,主要用于检测RNA的浓度。

  微毛细管电泳:

  可使用软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估,10为RNA完整性最好,0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高,可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。

  3’-5’完整性检测:

  是在一个RNA样本中检测GAPDH mRNA的完整性来代表所有RNA的完整性,主要用于检测RNA的完整性。


  得到高品质RNA的小建议:

  1、尽量避免RNA酶污染,使用无RNA酶的耗材和试剂,建议将扩增前后的场所分开。

  2、尽量减少采样时间,样品处理后快速冷冻,可以加入RNA保护剂。

  3、RNA提取过程中可以使用RNA酶抑制剂。

  4、存储过程中避免反复冻融。


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