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为什么我的Transwell实验总是失败呢,Transwell实验失败问题梳理总结

发布时间:2022-04-18 10:31:41 阅读:11962次 来源:合肥知恩

  我们常常用Transwell实验来进行细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭,相对来说,Transwell的操作简单,而且重复性也比较好,尽管如此,仍然有小伙伴栽在了Transwell上:为什么我的Transwell实验总是失败呢?今天就为大家梳理一下,Transwell实验中一些需要注意的问题,减少失败的几率。

  Transwell孔径用对了吗?

  Transwell技术的名称来自于就是一个叫Transwell小室(如下图),可以放在细胞培养板里面。有不同形状,不同大小,不同选择。但无论如何,它的关键部分都是一样的,那就是杯子底层的那张膜。这张膜一般是聚碳酸酯膜,带有微孔,孔径大小有0.1-12.0 µm。根据不同的实验需要,需要选用不同的孔径,共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究,应用的孔径是有区别的。

Transwell小室结构示意图

  Transwell小室结构示意图

  (1).细胞共培养:

  将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。应选择﹤3.0 µm孔径。因为﹤3.0 µm孔径,细胞不会迁徙通过。

  (2).细胞趋化:

  ①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

  ②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

  应选择5.0、8.0、12.0 µm孔径,上室细胞可穿过膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

  (3).细胞迁移:

  上室种细胞,一般是具备迁移能力的肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑。应选择8.0、12.0 µm孔径,计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。

  (4).细胞侵袭:

  常用8.0、12.0 µm 孔径,原理和方法与细胞迁移实验类似。

图例

  容易引起Transwell失败的纰漏问题

  ① 重复使用的问题:

  Transwell小室按照要求,都是一次性使用的。不过因为价格昂贵,其实洗洗泡泡还是可以重复用的。用完后用胰酶和75%酒精泡,室温凉干。再次使用前用紫外里里外外都照上30 min。就可以啦。

  ② 上层培养液:

  上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2% BSA。

  ③ 下层培养液:

  下层培养液采用含5%-10% FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

  ④ 细胞培养板:

  常用的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等。细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。不要一个大一个小,不配套啊。

  ⑤ 细胞计数:

  那么,细胞迁移到下室了,如何计数和比较呢?用PBS缓冲液洗细胞1-2次,吸尽残余的液体,加入甲醇固定20分钟,弃固定液,加入结晶紫染液,染色10-20分钟,弃染色液,用PBS冲洗干净即可。如下图所示,哪组迁移的多,哪组迁移的少,是不是一目了然了呢?

图例


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1057.html

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