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GST pull-down和CoIP有何区别?实验结果该如何解读?

发布时间:2022-04-14 10:34:22 阅读:14002次 来源:ProteintechGroup

  两天有小伙伴在后台咨询GST pull-down实验的相关问题,很遗憾前期并未整理相关的内容。通过查阅资料,小P发现其实GST pull-down实验和CoIP实验原理是非常相似的!今天就简单介绍一下两者的异同,同时结合文献案例给大家分享一下CoIP和GST pull-down实验结果的分析方法。

  01

  GST pull-down实验原理

  GST,全称glutathione-S-transferase,即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白,能够和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)稳定结合。我们把GSH与琼脂糖交联形成GSH琼脂糖珠,就能够将带有GST标签的诱饵蛋白固定,当体系中存在与诱饵蛋白有直接相互作用的靶标蛋白时,它就能够与微珠固相复合物结合而被“拉”下来。

图例

  02

  CoIP实验原理

  CoIP,Co-Immunoprecipitation,即免疫共沉淀实验,它通过一种偶联有Protein A/G的琼脂糖微珠或磁珠(Protein A/G能够特异性结合免疫球蛋白),将诱饵蛋白的抗体固定,随后再通过该抗体固定诱饵蛋白,当与诱饵蛋白有相互作用的靶标蛋白与此固相复合物混合时就可被吸附而“沉淀”下来。

图例

  从两者的实验原理我们不难发现,GST pull-down和CoIP实验都是通过一种多组分的固相复合物将诱饵蛋白固定,随后富集靶标蛋白,从而确定靶标蛋白和诱饵蛋白互相作用的事实,整体思路是很类似的;不过由于固定诱饵蛋白的方法不同,二者在适用范围上,以及实验难度上均有差异。

  GST pull-down一般用于体外实验,因为诱饵蛋白是需要加上GST标签的重组蛋白,所以是非生理状态下的验证,蛋白质的结构和形式可能与天然状态下存在一定差异,一般用于体外验证两个已知蛋白的直接相互作用。在实验难度上,重组诱饵蛋白一般采用原核表达体系,有高效的商业化载体(真核表表达体系也可以做,但需要找到合适的载体);并且固相复合物组分更少,有商业化的GSH琼脂糖珠,所以整个实验相对而言难度较低。

  CoIP实验反映的是两个蛋白在体内或细胞水平的相互作用,因为在进行CoIP检测时,样本一般源于非变性裂解细胞,活细胞状态下蛋白质之间的相互作用被保持,所以其反映的是细胞中真实的蛋白互作情况,但是诱饵蛋白和靶标蛋白之间是直接作用还是有其它蛋白介导的间接相互作用无法确定。在实验难度上,因为固相复合物组分多,需要非变性环境,并且对诱饵蛋白抗体的质量有较高要求,所以整个实验相对而言难度较大。

  综合而言,GST pull-down实验和CoIP实验其实是相互补充的两种实验方法,通过二者结合,我们才能更准确地了解两个蛋白之间的真实互作情况。

  对于很多文献中CoIP和GST pull-down实验结果图,许多刚踏入科研领域的小伙伴可能不是很熟悉,看不大明白。今天咱们就根据文献案例来具体展示一下两种实验结果的分析过程。

  本次以2019年6月发表在《Nature Cell Biology》 期刊(IF=17.728)上题为“An ARF6–Exportin-5 axis delivers pre-miRNA cargo to tumour microvesicles”的一篇文章为例,该文章引用了多支Proteintech抗体,并且研究中进行了大量的CoIP实验和GST pull-down实验。其中Fig.2c的CoIP实验结果如下:

Fig.2c的CoIP实验结果

  要想看懂上面这个CoIP实验结果图,我们首先需要了解以下几个关键术语:

  IP:immunoprecipitation,代表免疫沉淀,富集目的蛋白;

  IB:immunoblotting,免疫印迹,即Western Blotting ,显示目的蛋白;

  Input:阳性对照,就是用IP前的样品做WB (排除假阳性干扰);

  Myc、HA均为蛋白标签。

  整图从下往上看,首先看Input部分,有三张WB结果:

  IB:Tublin代表以Tubulin抗体(anti-Tubulin)对样本进行WB检测(这里图片中Tublin应该是笔误,实为Tubulin,Tubulin是常用的内参蛋白),条带1、条带2表明两个细胞裂解液样本中均能检测到Tubulin蛋白,并且上样水平一致,表明裂解液样本制备没有问题;

  IB:HA代表以HA抗体(anti-HA)对样本进行WB检测,条带3处空白,表示该样本中没有HA标记的蛋白,条带4表示该样本中存在HA标记的蛋白(ARF-WT-HA);

  IB:Myc代表以Myc抗体(anti-Myc)对样本进行WB检测,条带5和条带6表明两个样本中均含有带Myc标签的蛋白(myc-Exportin-5);

  (Input部分检测的是未经过IP处理的样本,是一种阳性对照,显示实验组和对照组中样本的成分,同时也确保了实验操作无误。)

  其次看IP部分,该实验采用的是IP:HA,表明是用HA标记的蛋白(ARF-WT-HA)作为诱饵蛋白,使用HA抗体(anti-HA)作为诱饵蛋白抗体进行IP实验,而靶标蛋白则是带Myc标签的蛋白(myc-Exportin-5)。IP:HA部分有两张WB结果:

  IB:HA同样代表以HA抗体(anti-HA)对样本进行WB检测,IB:Myc同样代表以Myc抗体(anti-Myc)对样本进行WB检测。不同的是,此次检测的样本是经过IP处理之后的样本,通过条带7、8、9、10我们可以看见,当样本中存在ARF-WT-HA蛋白(条带8)时,通过CoIP实验就能将myc-Exportin-5蛋白(条带9)“沉淀”下来,反之,则不能。这实验初步证明ARF-WT-HA蛋白与myc-Exportin-5蛋白之前存在相互作用,但无法确定二者是直接作用,还是间接作用。

  为此,该作者又进行了GST pull-down实验。Fig.2d实验结果如下:

Fig.2d实验结果

  可以看见GST pull-down实验结果图,与CoIP实验非常类似,主要也分为两部分:

  Input部分检测未经过GST pull-down处理的样本,也是一种阳性对照。Input部分有三张WB结果:

  GAPDH代表以GAPDH抗体(anti-GAPDH)检测样本中GAPDH蛋白水平(GAPDH和Tubulin一样,都是常用的内参蛋白),表明四个样本蛋白水平一致;

  GST-ARF6代表以GST-ARF6抗体(文中采用的anti-ARF6)检测样本中重组蛋白GST-ARF6水平;其中第4组(每一列为一组)实验未添加重组蛋白GST-ARF6;

  Exportin-5代表以Exportin-5抗体(anti-Exportin-5)检测样本中Exportin-5蛋白水平,四组实验中均有Exportin-5蛋白。

  随后再来看GST pull-down之后的实验数据,有两张WB结果图,我们可以看到体系中存在GST-ARF6蛋白时,通过GST pull-down就能将Exportin-5给“拉”下来,反之则不能;并且通过四组实验对比发现;GTP-γ-S的存在能够促进GST-ARF6和Exportin-5的直接相互作用。

  综合上述两个实验结果,我们可以初步得出结论:ARF6蛋白与Exportin-5之间存在直接相互作用,并且GTP-γ-S的存在能够促进二者之间的结合。

  总体而言,GST pull-down和CoIP实验都是两种比较有效的蛋白互作验证方法,有各自的优势,但也有对应的局限,如果想要拿到一个漂亮并有说服力的实验数据,最好两种实验都能验证一下~


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1046.html

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