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实时荧光定量pcr检测具体实验步骤

2023-03-01 10:40:22
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  实时荧光定量pcr检测技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

  以下便是实时荧光定量pcr检测具体实验步骤:

  1 、样品RNA的抽提

  ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

  ②两相分离:每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

  ③RNA沉淀:将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

  ④RNA清洗:移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。

  ⑤RNA干燥:小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

  ⑥溶解RNA沉淀:溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

  2、 RNA质量检测

  1)紫外吸收法测定

  先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。

  ① 浓度测定

  A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:

  RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21

  RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

  取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为:

  35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

  ②纯度检测

  RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。

  2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

  ①制胶:1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

  ②准备RNA样品:取3μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

  ③电泳:上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

  ④紫外透射光下观察并拍照:28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果......

  目前,实时荧光定量pcr检测技术广泛应用于各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。而且由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸,因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。


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