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细胞爬片制备具体过程​解析( 细胞爬片详细操作方法以及技巧)

发布时间:2022-03-21 10:34:44 阅读:16472次 来源:百度学术

细胞爬片制备具体过程解析( 细胞爬片详细操作方法以及技巧)

  爬片的准备

  1.爬片可用一般的盖玻片,也可用专用爬片;

  2.将盖玻片剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪时用小沙轮轻划一下,稍用力掰开。如接种大皿,请不要将盖玻片切开,直接清洁后放入培养皿中,待染色时再切开,这样既保证了细胞均一性,又可同时做多个指标的染色。

  3.将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡过夜,次日用自来水冲20遍,置于无水酒精中浸泡6小时,再用三蒸水冲洗3遍(主要目的是将酸冲洗干净,以免影响细胞贴壁效果),置于玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

  4.高压消毒后取出放入烤箱中烤干,放入超净台备用。

  细胞爬片

  1.胰酶消化细胞后,计数重悬细胞于完全培养基中。

  2.根据玻片的大小加入细胞,向每孔中预留的放置爬片的位置处滴少量培养基,目的是使玻片与培养皿粘合到一起,然后放入玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

  3.根据需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可

  4.待细胞贴壁后,去上清,加含药培养基。

  5.按照实验设计,一段时间后取出玻片。取玻片时,将注射器针尖向背面弯曲,将爬片轻轻勾起,用小镊子取出。

  6.将所需数量的爬片取出时,应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可继续培养。

  细胞爬片的固定

  1.细胞爬片取出后,用PBS洗2遍再做固定(此步骤可根据研究目的做取舍,比如做凋亡细胞染色时可免洗,凋亡的细胞在清洗的过程中有可能脱落)。

  2.用培养皿保存细胞爬片。在皿底放一层面巾纸,再放爬片,(方便取片)。然后盖上盖子,做好标记,用透明胶带将盖子和皿连在一起,-20℃保存。

  3.放-20℃保存之前,吸干培养基或PBS,-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。

  以下为常用的固定液(按需选择)

  1.冷丙酮:可用于一般的免疫组化染色。

  将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心,丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性,注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严,防止其挥发)固定10分钟。取出后,室温吹干,然后放入-20℃保存。

  2.多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

  主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胞分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

  室温固定15分钟后,将表面液体吹干,-20℃保存

  3. 95%乙醇,可用于免疫组化。

  优点:穿透性强、抗原性保存较好。

  缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间胶长,抗原会流失而减弱反应强度。

  室温固定15分钟后,将表面液体吹干,-20℃保存

  4. 甲醛(福尔马林)应用最广

  优点:形态结构保存好,且穿透性强,

  缺点:甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/967.html

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