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聚合酶链式反应PCR原理、步骤、应用

发布时间:2022-02-05 10:17:55 阅读:13472次 来源:百度学术

  PCR是一种酶促过程,其中DNA的特定区域一遍又一遍地复制以产生特定序列的许多拷贝。

  最广泛使用的靶核酸扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)。

  该方法将互补核酸杂交的原理与通过无数循环重复应用的核酸复制原理相结合。

  该方法能够扩增单个拷贝的核酸靶标,通常无法通过标准杂交方法检测到,并在相对较短的时间内扩增至 10 7或更多拷贝。因此,这提供了可以通过多种方法容易地检测到的充足目标。

  PCR的原理

  核酸的靶序列变性为单链,添加对每个靶链序列特异的引物,DNA聚合酶催化添加脱氧核苷酸以延伸并产生与每个靶序列链互补的新链(循环1)。在第 2 轮中,第 1 轮的两条双链产物都变性,随后作为 DNA 聚合酶进行更多引物退火和延伸的靶标。在 25 到 30 个循环之后,通过这种热循环可以产生至少 10 7个目标 DNA 拷贝。

  PCR 的要求

  PCR 反应包含目标双链 DNA、与目标相反链上的侧翼序列杂交的两个引物、所有四种脱氧核糖核苷三磷酸和一种 DNA 聚合酶以及缓冲液、和水的辅助因子。

  由于反应会周期性地加热到高温,因此 PCR 依赖于使用热稳定的 DNA 聚合酶。

  许多来自嗜热细菌(生活在高温环境中的细菌)的这种热稳定酶现在可以在商业上买到。

  第一个也是最常用的是来自嗜热细菌水生栖热菌的 Taq 聚合酶。

  涉及的步骤

聚合酶链式反应

  A. 目标核酸的提取和变性

  对于 PCR,首先通过加热、化学或酶促方法从生物体或可能含有目标生物体的临床样品中提取(释放)核酸。

  提取后,将目标核酸添加到包含 PCR 所需的所有成分(引物、核苷酸、共价离子、缓冲液和酶)的反应混合物中,然后放入热循环仪中进行扩增。

  B. 扩增步骤

  常规 PCR 涉及 25 到 50 个重复循环,每个循环包括三个连续反应:

  靶核酸变性

  引物与引物靶双链体的单链靶核酸延伸退火。

  引物-目标双链体的延伸

  变性

  将反应混合物加热至 95°C 并在短时间内(约 15-30 秒)将目标 DNA 变性为可作为 DNA 合成模板的单链。

  引物退火

  将混合物快速冷却至规定温度,使两种引物与靶DNA两侧的两条链中的每条链上的序列结合。

  引物是短的、单链的核酸序列(即,通常为20至30个核苷酸长的寡核苷酸),被选择用于与特定的核酸靶标特异性杂交(退火),基本上起到探针的作用。

  仔细计算此退火温度以确保引物仅与所需的 DNA 序列结合(通常在 55 o C 左右)。

  一个引物与每条链结合。两条亲本链不会相互重新退火,因为引物远远超过亲本 DNA。

  延期

  将混合物的温度升高到 72°C(通常)并在该温度下保持预设的时间段,以允许 DNA 聚合酶通过复制单链模板来延长每个引物。

  引物与目标序列的退火提供了必要的模板格式,允许 DNA 聚合酶将核苷酸添加到每个引物的 3' 末端(末端)并延伸与目标模板互补的序列

  Taq 聚合酶是常用于引物延伸的酶,在 72°C 时发生。之所以使用这种酶,是因为它能够在高温下有效发挥作用,并能在几个循环中承受 94°C 的变性温度。

  允许引物退火和延伸在升高的温度下发生而不损害聚合酶的能力增加了反应的严格性,从而降低了非靶核酸扩增(即非特异性扩增)的机会。

  重复 PCR 循环的三个步骤。

  因此在第二个循环中,四股链变性、结合引物并延伸。无需添加其他反应物。这三个步骤在第三个循环中重复,以此类推为一组附加循环。

  到第三个循环时,一些 PCR 产物仅代表两个引物位点之间的 DNA 序列,并且序列不会超出这些位点。

  随着越来越多的反应循环进行,双链DNA的合成数量也越来越多。在 20 个循环后,原始 DNA 已扩增一百万倍,在 30 个循环后增加到十亿倍(1000)百万。

  三、产品分析

  扩增产物的凝胶电泳通常在扩增后进行。

  扩增的 DNA 根据其分子大小通过琼脂糖凝胶电泳进行电泳迁移。

  扩增的 DNA 形成清晰的条带,可在紫外 (UV) 光下观察到。

聚合酶链反应

  PCR的优势

  PCR(聚合酶链式反应)是一种极其简单但非常强大的技术。

  只要已知其任一侧的短序列,它就可以对任何特定的 DNA 序列进行大量扩增。

  允许更快的诊断和识别,同时提高灵敏度和保持特异性。

  PCR的应用

  PCR 已经有非常广泛的应用,并且正在定期设计新的用途。

  PCR 可以从复杂的混合物中扩增单个 DNA 分子,在很大程度上避免了使用 DNA 克隆来制备该分子的需要。该技术的变体可以类似地从复杂混合物中扩增特定的单个 RNA 分子。

  使用 PCR 大大简化了 DNA 测序,这种应用现在很常见。

  通过使用合适的引物,可以使用 PCR 来创建目标 DNA 的点突变、缺失和插入,这极大地促进了基因表达和功能的分析。

  PCR 非常灵敏,可以扩增极少量的 DNA。因此,使用适当的引物,可以在组织中检测到非常少量的特定细菌和病毒,这使得 PCR 对医学诊断非常有价值。

  现在,PCR 对于表征医学上重要的 DNA 样本非常宝贵。例如,在筛查人类遗传疾病方面,它正在迅速取代 RFLP 的使用。

  由于其极高的敏感性,PCR 现在对法医学至关重要。甚至可以使用 PCR 扩增单根人类头发或犯罪现场留下的微小血滴的 DNA,以便进行详细表征。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/785.html

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