免疫组化双染色技术可用于可视化两种或多种抗原，并分析它们的定位、形态和功能之间的关系。
连续切片双重染色
连续切片染色可能是可视化两种抗原的最简单方法。如名称所示，它分别在相邻的两个切片上染色两种抗原。因此，它有效地防止了干扰和假阳性结果。但是，相邻的两个部分可能在某些方面有所不同，例如像元大小、类型和数量。需要重复实验来减小标准偏差。
免疫荧光双染
直接染色：
将切片与分别与两种荧光染料（例如 FITC 和 TRITC）结合的两种一抗混合孵育
或者，用两种一抗依次孵育切片；
显微处理时应设置两个波长的激发光，并通过图像软件合成合并图像。
间接染色：
在间接免疫荧光双染色中，一抗不含荧光染料。用一种一抗和相应的二抗孵育切片，然后用另一种孵育。处理显微镜并通过图像软件合并图片。
免疫酶学双染（推荐双酶）：
用两种一抗孵育切片；
用与两种不同酶（例如 HRP、AKP）或抗 HRP（PAP 复合物）、抗 AKP（APAAP 复合物）偶联的相应二抗孵育切片。
注意：*HRP 抗体应在 AKP 之前孵育。
*进行预实验以防止交联反应。
