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分子实验-免疫荧光实验方法讲解(免疫荧光实验步骤原理)

发布时间:2022-01-11 10:30:15 阅读:16862次 来源:百度学术

  免疫荧光是一种主要用于生物样品的测定法,经典定义为使用抗体在细胞环境中检测抗原的程序。抗体对其抗原的特异性是免疫荧光的基础。

  某些染料吸收一种特定波长的光线(紫外线)并以不同的波长(可见光)发射它们的特性称为荧光。在免疫荧光测试中,在紫外光下发光的荧光染料用于检测/显示抗原和抗体的特定组合。常用的染料是异硫氰酸荧光素,发出黄绿色荧光。免疫荧光测试也称为荧光抗体测试 (FAT)。

  荧光染料,例如异硫氰酸荧光素和丽丝胺罗丹明,可以用抗体分子标记。它们分别在荧光显微镜下的紫外线 (UV) 下发出蓝绿色和橙红色荧光。这构成了免疫学测试的基础。免疫荧光测试在研究和诊断中有广泛的应用。这些测试大致有两种类型:

  直接免疫荧光试验

  直接免疫荧光测试用于通过使用与未知抗原直接相互作用的已知标记抗体来检测细胞或组织中的未知抗原。如果存在抗原,它会与标记的抗体反应,并在荧光紫外光下观察抗体包被的抗原。它涉及使用标记的抗病毒抗体。

  直接免疫荧光试验方法

  将标本放在载玻片上;然后将荧光标记的抗体添加到其中并允许一段时间进行抗原-抗体反应。然后洗涤制剂,除去抗原和荧光标记抗体的复合物以外的其他成分。在显微镜下(荧光显微镜),观察到抗原-抗体复合物由于附着在抗体上的染料而发出荧光。

  需要为每种病原体制备单独的标记抗体是直接免疫荧光检测的主要缺点。

免疫荧光

  间接免疫荧光试验

  间接荧光是一种双抗体技术。已结合抗原的未标记抗体通过针对未标记抗体的荧光抗球蛋白试剂显现。间接免疫荧光检测用于检测血清和其他体液中的特异性抗体,用于多种传染病的血清诊断。

  间接免疫荧光试验方法

  间接免疫荧光是一个两阶段的过程。

  第一阶段:将已知抗原固定在载玻片上。然后将要测试的患者血清涂在载玻片上,然后仔细清洗。如果患者的血清中含有针对该抗原的抗体,它将与载玻片上的抗原结合。

  第二阶段:抗体与抗原的结合可以通过添加荧光染料标记的抗体来检测人IgG,并通过荧光显微镜检查。

  间接免疫荧光测试的第一步是将固定抗原(例如,在细胞或组织中)与未标记的抗体一起孵育,该抗体与抗原结合。仔细清洗后,将荧光抗体(例如荧光标记的抗 IgG)添加到涂片中。第二抗体将与第一抗体结合,抗原-抗体复合物可以在荧光显微镜上观察到。

  间接方法的优点是使用单一标记的抗球蛋白(IgG 抗体)作为“通用试剂”来检测许多不同的特异性抗原-抗体反应。该测试通常比直接免疫荧光测试更敏感。

  间接免疫荧光检测广泛用于:

  检测特异性抗体,用于梅毒、钩端螺旋体病、阿米巴病、弓形虫病和许多其他传染病的血清诊断;

  通过使用对不同免疫球蛋白同种型特异的荧光抗体来识别给定抗体的类别;

  通过使用单克隆抗体和细胞荧光图来识别和计数淋巴细胞亚群;和

  检测自身抗体,例如自身免疫性疾病中的抗核抗体。

  免疫荧光也可用于分析蛋白质、聚糖以及小的生物和非生物分子的分布。免疫荧光已广泛应用于生物学研究和医学研究。

  免疫荧光的主要限制是该技术需要

  昂贵的荧光显微镜和试剂,

  训练有素的人员

  具有可能导致错误结果的主观因素

  生物样品包括组织和细胞。免疫荧光有助于评估特定样本中的细胞是否表达研究中的抗原。在发现免疫阳性信号的情况下,免疫荧光还有助于确定哪些亚细胞区室正在表达抗原。免疫荧光可用于培养的细胞系、组织切片或单个细胞。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/701.html

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