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细胞免疫荧光染色(免疫荧光染色原理)

发布时间:2022-03-09 10:32:24 阅读:19202次 来源:生物在线

  免疫染色包括免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)、免疫细胞化学(ICC)等,可以参考如下步骤进行操作。

  样品准备

  对于贴壁细胞:

  可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培养细胞,然后到预定时间时进行固定等后续操作。

  也可以用洁净的盖玻片,70%乙醇中浸泡后,用无菌的镊子放置到6孔板内,然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养,待细胞贴在盖玻片上生长良好后,即可进行固定等后续操作。

  对于悬浮细胞:

  把细胞先在固定液中固定,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳,可以在载玻片上用PDL等物质进行处理,以增强载玻片的粘附能力。

  对于冷冻切片:

  切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。

  对于石蜡切片:

  脱蜡:切片在二甲苯中脱蜡5分钟,再换用新鲜的二甲苯脱蜡,共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟,两次。90%乙醇5分钟,两次,70%乙醇5分钟,一次。蒸馏水5分钟,两次。

  抗原修复:根据不同的抗原和抗体,可以选择把切片放置在如下抗原修复液中,10mM柠檬酸钠,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris,pH10.0,95℃加热12分钟,大约在30分钟内缓慢冷却至室温。

  固定

  可以使用适当的固定液固定细胞或切片,例如百奥莱博的免疫染色固定液(YT086)。固定完毕后,可以用免疫染色洗涤液(YT089)洗涤两次,每次5分钟。

  封闭

  加入免疫染色封闭液(YT087),封闭60分钟。如果背景较高,可以4℃封闭过夜。

  从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。

  在整个免疫染色过程中我们推荐使用侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落,也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行,即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动,但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。

  一抗孵育

  参考一抗的说明书,按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(YT088)稀释一抗。

  用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。

  回收一抗。加入免疫染色洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

  二抗孵育

  参考二抗的说明书,按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(YT090)稀释荧光标记的二抗,或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(YT091)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。

  用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

  回收二抗。加入免疫染色洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

  蛋白检测

  对于免疫荧光染色,此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。

  对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物,或AB检测体系等进行后续检测。

  多重染色

  如果进行的是免疫荧光染色,通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应,例如DAB染色,一般不适合再进行多重染色。

  多重荧光染色:

  可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(YT115)进行红色荧光染色,随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(YT109)进行绿色荧光染色,在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(YT118)对细胞核进行染色,染色后为蓝色荧光。

  用HE染色进行复染:

  免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(YT165)进行HE染色。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/916.html

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