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pcr可用于哪些领域(pcr技术的种类及其应用)

发布时间:2022-01-18 10:11:21 阅读:114712次 来源:赛默飞

  PCR是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代,研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA。然而直到1983年,Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具,就是我们今天所熟知的PCR方法。从此以后,PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分,被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。

  pcr可用于哪些领域?

  1. 基因表达

  通常可通过PCR来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先,从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后,通过由PCR扩增的cDNA数量,确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR, RT-PCR

  终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量(一种半定量方法)。例如,对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化,然后对条带强度进行定量,并以管家基因为参照进行标准化,预估扩增靶点的相对表达水平[1] [2]。如今,终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了,因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。

  2. 基因分型

  PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如,基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型[3]。引物对经设计位于目标区域侧翼,可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异

  但是如果为了检测特定核苷酸突变,则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如, PCR扩增子测序就是研究单核苷酸变异(SNVs)和单核苷酸多态性(SNP)的方法之一。强烈推荐使用高保真DNA聚合酶,以防止在PCR过程中引入多余的突变。

  通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的 突变进行遗传分析的一个基本方式。

  3. 分子克隆

  PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆,该技术被称为 PCR 克隆。在直接PCR克隆中,DNA(如,gDNA、cDNA、质粒DNA)的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。

PCR克隆

  PCR克隆:通过PCR制备的插入片段被克隆到兼容载体中。(A) 直接PCR克隆技术包括TA和平端克隆。(B) 间接PCR克隆,扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰,如进行限制性酶切

  除了制备插入片段,PCR也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计,可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。

  4. 突变

  PCR克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中,以便进行突变研究。在 定点突变中,经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后,含有引入突变的PCR产物通过自我连接,重新生成环状质粒,并用于转化感受态细胞。

  5. 甲基化

  PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR(MSP)方法中,设计了两个引物对,以区分目标位点的甲基化状态[7][8]。

  首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品,将未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点,一对引物经设计 带有 鸟嘌呤(G),可与目标序列中的 m5C 配对;为了检测未甲基化位点,另一对引物带有腺嘌呤(A),可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对(随后,与后续PCR循环中的胸腺嘧啶(T)配对)。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态。

  甲基化研究中所使用的DNA聚合酶除了能够扩增富含AT的序列,还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中的U残基。而高保真DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域,所以不适用于MSP(除非经过特殊修饰)。

  实时PCR 可代替终点PCR,为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR,对PCR扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。

  6. 测序

  PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性,强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。

  在 Sanger测序中,PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点(如M13或T7“通用引物”结合位点)对PCR引物的 5′末端进行标记,以简化测序工作流程。

  二代测序 (NGS)中,PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中,DNA样品通过PCR反应富集(在起始量有限的情况下)并使用adaptor(以及用于多重检测的index)标记。除了具有高保真度,DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏好性,从而使测序文库具有高覆盖度。

  7. 医学、法医学和应用科学

  PCR技术不仅可用于基础研究,还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此,所使用的PCR仪和PCR试剂必须符合这些要求和目的。

  分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中,利用 PCR进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列(STR)进行扩增而区分个体的。在农业学中,PCR在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/740.html

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