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细胞划痕实验注意事项(要注意的几个细节)

2021-11-05 09:56:09
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  伤口愈合试验,也就是“划痕试验”,是一种广泛建立的研究体外集体细胞迁移的技术。细胞划痕(Wound Healing)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。

  细胞划痕实验原理

  细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合,在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,是研究细胞迁移的体外实验中简单的方法。细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。

  细胞划痕实验要注意的几个细节

  1、划痕前是不倒培养基的,划痕后再倒掉培养基加PBS清洗后加吴学谦培养基;细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。因此是整个培养皿都加培养基的,观察部位是划痕而已。

  2、通过算每个视野的划痕面积,可以通过image J 软件计算。

细胞划痕实验

  3、划痕法的意义在于,价格低廉,操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯,容易控制。(比如做加药的,可能会和血清的组分有反映,而且受血清批次的影响,造成误差。如果是铺了ECM物质的,组分就更复杂了。).划痕法测量适用的细胞范围较小,一般只适用于上皮细胞,纤维样细胞。因为a.这些细胞本身有迁移能力,且较强。b.细胞有极性,方便测量,观察。c.细胞对无血清有较强的忍受力(至少24小时),因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的,很多肿瘤细胞系在无血清培养下,12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。

  4、其实在伤口弥合中,fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单,我觉得应该是综合效应,而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移,显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质,侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说,可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动,是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。

  5、 细胞的密度;划痕实验一般是几种细胞的结合,但是每种细胞的生长速度会不一样,所以需要按照细胞的生长特性调整培养时间,细胞铺满孔底时划痕的效果会比较好,建议是100%的铺满。

  6、用枪头画线时尽量垂直,以6孔板为例 ,一个孔可以画6条线

  7、画线之后一定要用PBS洗两次,以去除划下的细胞

  8、注意培养方式一定要改成无血清或者低血清的培养基,因为:划痕后用无血清培养基培养细胞,意在说明在监测的 24 小时内,划痕的缩小是细胞 迁移作用的结果,所以要将细胞增殖造成细胞迁移的影响降到蕞低;但若细胞改成无血清培养后大面积漂浮,需要适量加入血清浓度不能高于2%。

  9. 放入37℃ 5% CO2培养箱,培养。可按0,10,12,15时间点取样,拍照(具体时间依实验需要而定)。

  10. 统计方法:使用Image J软件打开图片后,抓取自己画的线条,计算细胞间距离的平均值。

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