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细胞实验外包:细胞培养常见问题解答(50条常见问题解答汇总)

发布时间:2021-11-04 10:37:56 阅读:18632次 来源:百度学术

  细胞培养作为科研学术者来说是基础实验,是需要掌握的。对于已经掌握了的人来说,细胞培养很简单;然而对于还没有入门的人来说,不知所言。对于实验小白来说在细胞实验中会出现很多问题,Biotech针对实验中等常见问题进行汇总针对解答。

  细胞培养常见问题解答(50条常见问题解答汇总)

  1 冷冻管应如何解冻?

  取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

  2 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

  除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

  3 可否使用与原先培养条件不同之培养基?

  不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

  4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

  不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源, 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

  5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

  FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼,请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

  6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

  一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

  7 何时须更换培养基?

  视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

  8 培养基中是否须添加抗生素?

  除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。

  9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

  一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。

  10 悬浮性细胞应如何继代处理?

  一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。

  11 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

  欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。

  12 细胞之接种密度为何?

  依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

  13 细胞冷冻培养基之成份为何?

  动物细胞冷冻保存时zui常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。

  14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

  冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况, *次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

  15 冷冻保存细胞之方法?

  冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

  冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微

  降低一些。

  16 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

  冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

  17 应如何避免细胞污染?

  细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之方法。

  18 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

  直接灭菌后丢弃之。

  19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?

  不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。

动物实验问题

  20 支原体污染会对细胞培养有何影响?

  支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

  21 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?

  直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。

  22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?

  定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

  23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中,颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?

  培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。

  24 各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?

  不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

  25 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?

  研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误, 造成细胞的物理性损伤, 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

  26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

  研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。

  27 收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?

  冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

  另:这里补充一下培养用品的消毒,供参考:

  细胞培养的zui大危险是发生培养物的细菌,真菌和病毒等微生物的污染,污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常见的原因有操作间或周围空间的不洁,培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底,由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败,故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规,防止发生污染。

  消毒方法分为三类:

  (A) 物理灭菌法(紫外线、湿热、过渣等);

  (B) 化学灭菌法(各种化学消毒剂);

  (C) 抗生素。

  (1)紫外线消毒:用于空气,操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好,经一定的时间照射后,可以消灭空气中大部分细菌,培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米,且消毒进物品不宜相互遮档,照射不到的地方起不到消毒作用。

  紫外线可产生臭氧,污染空气,试剂及培养液都有不良影响,对人皮肤也有伤害,不宜近照射也进行实验操作。

  (2)温热消毒:即高压蒸气消毒,是一种使用zui广泛、效果的消毒方法。温热消毒时,消毒物品不能装得过满,以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险,保证其内气体的流通。在加热升压之前,先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气,冷气空气排出后,关闭排气阀门,同时检验安全阀活动自如,继后开始升压,当达到所需压力时,开始记算消毒时间。消毒过程中,操作者不能离开工作岗位,要定时检查压力及安全,防止消毒及表皮意外事件发生。

  常用物品消毒压力及时间:

  培养液、橡胶制品、10磅10分钟;

  布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。

  上两种是zui常见的物理消毒方法。

  (3)化学消毒法:zui常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭,前者主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

  (4)抗生素消毒:确切应记成抗生素灭菌,主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

  如果已经发生真菌污染,原则上应尽快丢弃,但是如果是比较珍贵的细胞系,可以用抗真菌药物来尝试抢救,用一般用量的5~10倍来冲击治疗,24~28h后换常规培养液。但是这种方法一般只是在污染早期才有效!

  35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

  二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

  44. 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗?

  一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

  45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?

  大部分添加物和试剂zui多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

  46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?

  胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。

  47.保存血清的方法?

  我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。

  48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?

  将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。

  49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?

  血清中沉淀物的出现有许多种原因,但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。

  若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。

  50. 为什么要热灭活血清?

  加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

  51. 有必要做热灭活吗?

  实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

  若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量!

  52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

  有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。

  53. 如何避免沉淀物的产生?

  我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:

  (1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。

  (2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

  (3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

  (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

  (5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

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