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免疫组化假阴性结果?如何解决阴性染色问题?

发布时间:2021-08-09 09:50:32 阅读:14522次 来源:本站

  要想正确判断免疫组化染色结果,我们需要好的免疫组化染色切片。然而染色过程反复多变,影响染色最终结果步骤环节太多,因此想得到高质量的染色切片不仅需要丰富的经验还需要各技术人员的相互配合、共同努力。尽管如此,但染色结果常见的问题就是出现无色片,即无阳性信号,出现这种情况有两种可能:真阴性结果和假阴性结果。

  什么是无色片?

  免疫组化染色结束后,切片中见不到任何阳性信号即为无色片。这是我们在实验中比较常见的现象。一般出现这种情况可能是:

  1.真阴性结果:染色过程无问题,细胞或组织的确不表达与抗体相关的抗原,这种情况不再多说,该怎么处理就怎么处理。

  2.假阴性结果:这种情况阴性结果并不是真实的反应。假阴性结果又可分为两种情况:

  (1)切片中原本就不包含预检测组织或细胞。这种情况无非是切片、抗体或者蜡块选错。要知道正确的切片染色才是获得正确结果的前提,因此我们在做切片的染色的时候要细心,不要出错。

  (2)在染色过程中某些或某一环节出错。例如,有些组织需要经过抗原修复才能检测到抗原表达,如果未进行抗原修复则可能会出现假阴性结果;有些抗体只适用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织;或突遇一抗失效,在理论上抗体失效是一个逐渐的过程,但也有例外,其主要原因则是抗体长期不用和/或已超过有效期;其他诸如忘加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢等等。

免疫组化实例图

  事实上这些简单的错误想要避免非常简单,只需要在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。

  如何解决阴性染色问题?

  我们可以通过设立“阳性对照”来解决这个问题。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,则表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。这时候我们需要仔细推敲寻找原因。

  阳性对照包括两种:一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。

  另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。

  因此,应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了解决这个问题,目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等,其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。

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