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流式细胞仪原理及应用(流式细胞术实验步骤类型、用途)

发布时间:2022-01-17 10:26:24 阅读:111432次 来源:本站

  流式细胞仪是一种基于激光的标准技术,用于检测和测量异质流体混合物中细胞或颗粒的物理和化学特性。

  多年来,流式细胞仪的使用有所增加,因为它可以快速分析细胞的多种特征(定性和定量)。

  可以通过此过程测量的特性包括粒子的大小、粒度或内部复杂性以及荧光强度。

  这些特性是使用光电耦合系统确定的,该系统基于细胞散射的激光检测细胞。

  流式细胞仪,尽管它的名字,不一定处理细胞。它经常处理细胞,但它也可以处理染色体或分子或许多其他可以悬浮在流体中的粒子。

流式细胞仪原理及应用(流式细胞术实验步骤类型、用途)

  流式细胞仪原理

  流式细胞术的基本原理是基于对粒子散射的光的测量,以及当这些粒子在流中通过激光束时观察到的荧光。

普通流式细胞仪的示意图

  光散射

  当粒子偏转入射激光时会产生光散射。这种情况发生的程度取决于粒子的物理特性,即其大小和内部复杂性。

  前向散射光 (FSC) 与细胞表面积或细胞大小成正比。它是对大部分衍射光的测量,并检测刚刚偏离入射激光束轴的光线,这些光线被光电二极管向前散射。

  侧向散射光 (SSC) 指示细胞的细胞粒度或细胞的内部复杂性。SSC 是测量发生在电池内任何界面上的折射和反射光的主要指标,其中折射率发生变化。

  FSC 和 SSC 的测量用于区分异质细胞群中的细胞类型。

  荧光

  用于检测系统中细胞分子(如蛋白质或核酸)表达的荧光标记。

  荧光化合物吸收该化合物特有的波长范围内的光能。

  这种光吸收导致荧光化合物中的电子被提升到更高的能级。

  激发的电子迅速衰变为其基态,以荧光的形式发出多余的能量,然后由检测器收集。

  在混合的细胞群中,可以使用不同的荧光染料来区分不同的亚群。

  每个亚群的荧光模式,结合 FSC 和 SSC 数据,可用于识别样品中存在哪些细胞并计算它们的相对百分比。

  然后,电子系统将检测到的光信号转换为可由计算机处理的电子信号。

  仪器/流式细胞仪部件

  流式细胞仪由三个主要系统组成:流体系统、光学系统和电子系统。

  流体学

  射流系统的目的是将流体流中的粒子传输到激光束。为此,将样品注入流动室内的鞘液流(通常是缓冲盐溶液)中。

  流动室的设计允许样品芯聚焦在鞘液的中心,然后激光束与颗粒相互作用。

  通过将样品悬浮液注入鞘液流的中心来实现聚焦。鞘液的流动使颗粒移动并将它们限制在样品芯的中心。

  光学系统

  细胞仪的光学系统由激发光学器件和收集光学器件组成。

  激发光学器件由激光器和透镜组成,这些透镜用于将激光束整形和聚焦到样品流中。

  收集光学器件包括一个收集透镜,用于收集粒子与激光束相互作用后发出的光,以及一个光学镜系统,将收集到的光的特定波长转移到指定的光学检测器。

  细胞或粒子通过激光后,侧面发出的光线和荧光信号被引导到光电倍增管(PMT),光电二极管收集信号。

  为了实现检测器对特定荧光染料的特异性,在管前放置一个滤光片,它只允许窄范围的波长到达检测器。

  电子系统

  电子系统将来自探测器的信号转换成计算机可以读取的数字信号。

  一旦光信号撞击 PMT 或光电二极管的一侧,它们就会被转换成相对数量的电子,这些电子被倍增以产生更大的电流。

  电流流向放大器并转换为电压脉冲。

  当粒子撞击光束中心时,达到脉冲的最高点,在这种情况下,达到最大量的散射或荧光。

  然后模数转换器 (ADC) 将脉冲转换为数字。

  流式细胞术的协议/程序/过程/步骤

  流式细胞仪的过程包括以下内容:

  样品制备

  在流式细胞仪中运行之前,被分析的细胞必须处于单细胞悬浮液中。

  在分析之前,应首先分别使用酶消化或组织的机械解离将聚集的培养细胞或存在于固体器官中的细胞转化为单细胞悬浮液。

  然后进行机械过滤,以避免不必要的仪器堵塞并获得更高质量的流量数据。

  然后将所得细胞与未标记或荧光偶联抗体一起在试管或微量滴定板中孵育,并通过流式细胞仪进行分析。

  抗体染色

  一旦制备好样品,细胞就会被涂有针对不同细胞上存在的表面标记物的荧光染料偶联抗体。这可以通过直接、间接或细胞内染色来完成。

  间接染色,细胞与直接结合荧光团的抗体一起孵育。

  在间接染色中,荧光团偶联的二抗检测一抗

  细胞内染色程序允许直接测量存在于细胞质或细胞核内的抗原。为此,首先使细胞具有渗透性,然后在渗透缓冲液中用抗体染色。

  运行样本

  首先,运行控制样本以调整检测器中的电压。

  设置流式细胞仪中的流速并运行样品。

  流式细胞仪的类型

  根据过程的目的和精度,有不同类型的流式细胞仪:

  传统流式细胞仪

  传统的细胞仪是使用鞘液聚焦样本流的普通细胞仪。

  传统流式细胞仪中最常用的激光器是 488 nm(蓝色)、405 nm(紫色)、532 nm(绿色)、552 nm(绿色)、561 nm(黄绿色)、640 nm(红色)和 355 nm(紫外线) .

  声学聚焦细胞仪

  在这些细胞仪中,超声波用于聚焦细胞进行分析。

  这可以防止样品堵塞并且还允许更高的样品输入。

  细胞分选机

  细胞分选仪是传统流式细胞仪的一类,允许用户在处理后收集样本。

  可以将对所需参数呈阳性的单元格与对参数呈阴性的单元格分开。

  成像流式细胞仪

  成像细胞仪是结合荧光显微镜的传统细胞仪。

  成像细胞仪允许在单个细胞和群体水平上快速分析样品的形态和多参数荧光。

  流式细胞仪应用/用途

  流式细胞术用于分子生物学、病理学、免疫学、病毒学、植物生物学和海洋生物学等多个领域。一些常见的应用包括:

  它在临床实验室中用于检测白血病等体液中的恶性肿瘤。

  像细胞分选仪这样的细胞仪可用于在不同的收集管中物理分离感兴趣的细胞。

  可用于荧光标记物的DNA含量检测。

  流式细胞仪允许通过使用荧光染料分析细胞周期的四个不同阶段的复制细胞。

  声学流式细胞仪用于研究血液和其他样本中的多重耐药菌。

  流式细胞仪可根据形态和生化变化的差异,检测细胞死亡、凋亡和坏死的不同阶段。

  限制

  该过程不提供有关蛋白质细胞内位置或分布的信息。

  随着时间的推移,碎片会聚集在一起,这可能会导致错误的结果。

  与样品制备和染色相关的预处理是一个耗时的过程。

  流式细胞术是一个昂贵的过程,需要高素质的技术人员。


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