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分子实验-免疫共沉淀(co-IP)实验技术原理

2022-01-03 10:33:25
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  蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者,参与几乎所有的重要生命活动。因此,蛋白-蛋白相互作用研究以及建立相互作用的关系网络图,具有十分重要的意义,也是目前蛋白质研究领域的热点。

  Co-IP(免疫共沉淀,co-inmunoprecipitation)是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术,能够特异性富集所研究的目的蛋白。由于过程中采用了非变性条件,保留了互作及复合体的细胞内状态。相对于酵母双杂交、pull down等方法,其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内,保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。

  Co-IP实验原理:

  以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

  当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

实验原理

  Co-IP实验优势:

  a) 取材可以选择该目的蛋白所在物种、特定组织、细胞,因此CoIP能够反应该蛋白在天然组织细胞状态下存在的互作关系蛋白;

  b) 找出整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白,研究复合体组成;

  c) 通过与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白,再通过其他技术进一步验证。

  Co-IP实验注意事项

  a)需要特异性IP级别诱饵蛋白抗体(重点);

  b)如果没有特异性抗体,则需要考虑构建重组标签质粒,用标签抗体进行CoIP实验;

  c)样品种类实验风险:过表达细胞样品<细胞样品<动物组织样品<植物样品(通常为转基因植物,标签抗体也很难达到特异性富集);

  d)CoIP-MS风险:由于存在特异性抗体高丰度蛋白,质谱不一定能够鉴定到诱饵蛋白。

  Co-IP技术案例分析

  a) 两个已知蛋白互作验证(体内实验)

  常规思路:通过一系列功能实验确定某个信号通路,明确通路相关蛋白并进行验证。

  文献中:通过CoIP-WB验证诱饵蛋白CEBPB和互作蛋白PGC1α是否结合,进一步确定HCP5/miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB通路在胃癌中的作用。

技术案例分析

  From:MSC-inducedlncRNA HCP5drove fatty acid oxidation through miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB axis to promotestemness andchemo-resistance of gastric cancer.

  b) 通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白(体内实验)

  常规思路:通过组学或其他手段确定某个功能相关蛋白,进一步筛选确定该蛋白作用机理,则可以选择CoIP-MS.

  文献中:通过CoIP-MS实验筛选到差异蛋白vimentin,CoIP-WB和GSTpull-down等方法进一步确定P62与vimentin互作。

实验

  c) 通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白(体内实验)

  特点一:使用EGFP融合蛋白标签做IP实验。

  特点二:则是通过两次平行CoIP-MS实验,除了筛选两次差异蛋白外,进一步将两次差异蛋白取交集缩小筛选范围,从中选择Ngb蛋白互作蛋白。

  Co-IP技术疑点分析

  1、Co-IP可不可以用珠子做?比如HIs GST的琼脂糖?

  答:Co-IP是通过磁珠与抗体形成的复合物进行富集,HIs GST的琼脂糖这些柱料不适用。

  2、请问Co-Ip如何选择合适的Input对照和同型对照?有什么要求和原则吗?

  答:Co-IP使用Input阳性对照即可,Input即实验使用的细胞裂解液。

  3、互作验证一定要western吗?纯化的蛋白可见呢?

  答:可见蛋白只能判断蛋白大小,还是需要WB确定就是目的蛋白。

  4、Co-IP时,Input的带型不够亮,怎么解决?

  答:可以瞬转过表达处理。

  5、两个蛋白,哪个适合ip有要求吗?

  答:有IP级别抗体的蛋白优先考虑作为诱饵蛋白。

  6、请问Co-IP,INPUT的加样量是多少?那IgG和IP的上样量相应有要求吗?

  答:通常上样量50ug/100ug。

  7、免疫共沉淀如何避免假阳性?

  答: Co-IP选择抗体尤为关键,特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高,则降低抗体浓度;若抗体特异性不好,则更换抗体。

  8、质谱结果几百个怎么分析可能的互作蛋白?

  答:如果蛋白较多,建议先做功能注释,从中选择与研究方向功能相关的蛋白;在这些蛋白通过质谱数据(得分)进一步排序,确认2-3个进行验证。

  9、请问是不是在不知互作蛋白的情况下,用质谱或其他方法筛选;如果已知互作蛋白,直接用Co-IP?

  答:已知蛋白互作验证CoIP-WB;未知蛋白互作筛选CoIP-MS。

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