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载体的基本特点和分类(基因载体的种类和特点)

发布时间:2022-01-16 10:31:45 阅读:125312次 来源:百度学术

  载体是一种物质,通常是一段 DNA,它携带一系列 DNA 或其他遗传物质并将其引入新细胞。

  载体作为载体将遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞,用于不同的目的,如繁殖、表达或分离。

  载体用作分子克隆程序中的工具,以便将所需的 DNA 插入物引入宿主细胞。

  通过载体传递的 DNA 插入片段称为重组 DNA,该过程也称为重组 DNA 技术。

  通常,载体是携带涉及不同功能的不同部分的 DNA 序列。载体通常有一个插入片段,也称为转基因,它携带重组 DNA 和一个更大的序列,称为载体骨架,负责载体的结构。

  向量可以根据不同的特征分为不同的类型。因此,向量的选择取决于过程的目的。

  载体是基因工程过程的重要组成部分,因为它们构成了 DNA 片段从一个细胞转移到另一个细胞的基础。

  载体具有携带基因序列并使它们能够在宿主细胞内存活的特殊特征。

  基因转移的过程在不同的载体中也有所不同,其中一些进入宿主细胞并掺入宿主DNA中,而另一些则只是将遗传物质传递到宿主细胞中并自行恢复。

  尽管载体通常是 DNA 序列,但病毒和其他颗粒也可以在转导等过程中充当载体。

  向量可以重复用于多个进程,因为这些可以在进程结束时恢复。

  克隆载体是克隆过程中必不可少的一类载体。这些载体具有不同的序列,使它们能够在宿主细胞中启动复制以及在宿主内传播。

载体

  载体的特征有哪些

  载体应该能够自主复制,而这又取决于载体中特定序列的存在,这些序列使它们能够在宿主细胞内启动复制和传播。一些载体甚至可能具有允许产生插入 DNA 所必需的蛋白质、调节过程以及在不同载体之间进一步转移插入物的序列。

  理想载体的大小也应该足够小,以便将其整合到宿主基因组中。载体的小尺寸也使其能够结合大尺寸的插入物进行转移。

  向量应该易于分离和纯化,因为它们需要被回收并重用于多个进程。

  为了使载体有效,它们还应该具有有助于确定宿主细胞是否已接收载体的过程的某些成分。该过程中使用的大多数载体都有一个基因,该基因可以提供对抗生素的抗性或产生特定类型的蛋白质。这些成分称为标记基因。

  许多载体还需要独特的限制酶识别位点,以便在存在特定限制酶的情况下插入载体 DNA。然而,许多载体被设计成具有接近多个克隆位点的一系列限制性位点,从而增加了可用于消化序列的可能的限制性内切酶。

  将载体引入宿主细胞应该很容易,这取决于许多因素。

  在基因转移过程的情况下,重要的是载体能够将自身或重组 DNA 整合到宿主细胞的基因组中。

  重要的是,将重组 DNA 引入载体不会影响载体的复制周期。

  载体类型

  根据过程的目的和过程中使用的粒子类型,矢量可以分为不同的组。以下是用于不同目的的常用向量组;

  1. 克隆载体

  克隆载体是能够自主复制并因此用于在宿主细胞内复制重组DNA的载体。

  克隆载体负责确定哪些宿主细胞适合复制特定的 DNA 片段。

  克隆载体是由每种载体特有的不同特征定义的进一步不同的类型。

克隆载体

  质粒载体

  质粒是能够在宿主细胞内自主复制的小的染色体外环状 DNA 分子。

  这些也被称为重组 DNA 技术中的主力克隆载体。

  质粒在生命的所有三个领域都被广泛用作载体。然而,这些常用于细菌和酵母菌中。

  使它们成为最佳载体之一的质粒最重要的特征是它们的体积小。质粒的小尺寸有助于将重组 DNA 从宿主的基因组 DNA 中分离出来。

  质粒的大小范围从几千个碱基对到超过 100 个碱基。然而,载体的小尺寸确实会影响它可以携带的插入 DNA 的最大尺寸。

  质粒可以携带小于 20 kb 的插入 DNA,因为克隆效率和质粒稳定性会随着载体的大小而降低。

  由于存在可以独立于宿主复制周期启动质粒复制的基因和序列,使得质粒的自主复制成为可能。

  细菌质粒包含 ori 序列,不仅控制质粒复制,而且确定两种质粒在同一宿主细胞中共存的可能性。

  不同的质粒具有不同类型的选择性标记,但最常见的标记包括抗生素抗性和 β-半乳糖苷酶的产生。

  一些最广泛使用的质粒是使用大肠杆菌作为宿主的 pBR322、pUC 和 pBluescript 载体。

  粘粒

  粘粒载体是由质粒和噬菌体 λ 载体组成的杂交载体,能够掺入多达 42 kb 的 DNA。

  通过将噬菌体载体的cos区插入质粒载体制备粘粒载体。

  粘粒载体是大小从 400 个碱基对到 30 kb 不等的大型载体。这些可以携带大小范围为 28 至 46 kb 的 DNA 序列。

  创建粘粒载体是为了掺入质粒无法携带的大尺寸 DNA 分子。

  由于这些是杂合载体,它们可以像质粒一样在宿主细胞内复制或像噬菌体一样保持包装。

  除了促进噬菌体头部填充的信号序列外,粘粒载体没有很多噬菌体特征。

  粘粒的混合结构使噬菌体头部能够整合到所有供体 DNA 中以进行转移。

  多年来,粘粒载体的使用和生产有所增加,因为包装系统对于回收较大的杂种具有高效和选择性。

  实际制备和使用的粘粒载体的一个例子是粘粒pHC79,它是载体pBR322的含cos衍生物。

  噬菌体载体

  噬菌体载体是仅感染细菌并在携带大型插入物时有效转化它们的病毒。

  噬菌体或噬菌体具有更高的转化效率,这增加了回收含有重组 DNA 片段的克隆的机会。

  噬菌体最重要的特征是能够整合大型真核基因及其调控元件的包装系统。

  噬菌体的使用还有助于分离大量可用于分析插入片段的 DNA。

  尽管有许多噬菌体可以并且已经用作载体,但噬菌体 λ 是最方便的克隆载体。

  它可以选择性地包装一条长约 50 kb 的染色体,并且可以通过去除基因组的中心部分来调整噬菌体的大小,因为它不是复制或包装供体 DNA 所必需的。

  使用可以整合更大 DNA 片段的噬菌体载体减少了获得具有生物体整个基因组的特定 DNA 文库所需的克隆数量。

  噬菌体载体作为克隆载体也是有效的,因为克隆过程后形成的重组分子被包装成感染性颗粒,然后可以有效地储存或处理。

  用作载体的一些常见噬菌体包括 M13 噬菌体、λ 噬菌体和 P1 噬菌体。

  细菌人工染色体

  细菌人工染色体是工程化的 DNA 分子,用于克隆细菌细胞(通常是大肠杆菌)中的 DNA 片段。

  这些由细菌衍生的 F 因子复制起点组成,该复制起点能够以超螺旋环状形式传播大的 DNA 片段。

  与质粒或噬菌体载体相比,细菌人工染色体可以携带更大尺寸的插入 DNA。

  这些载体被认为优于其他人工染色体,如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体,因为在细菌中发现的 F 因子减少了在此过程中可能出现的插入嵌合和不稳定性。

  这些是高效的,因为可以将多达 300,000 个碱基对的 DNA 片段插入细菌人工染色体中,从而减少为获得所需结果而进行的克隆和循环次数。

  BAC 文库已用于为定位克隆、物理作图和基因组测序等过程生成大型基因组 DNA 插入片段。

  与其他类似载体相比,BAC 克隆系统由于其稳定性和易用性而越来越多地用于基因工程。

  然而,BAC 与 DNA 片段随机插入宿主基因组有关,导致无法预测的表达。

  酵母人工染色体

  酵母人工染色体是工程化的 DNA 分子,用于克隆酵母细胞内的 DNA 插入片段,特别是酿酒酵母。

  已经开发了 YAC 以克隆大的 DNA 序列,从而提高该过程的效率。

  YAC 可以克隆多达 500 kb 的 DNA,这比大多数传统的克隆载体要高得多。

  尽管这些经常用作克隆载体,但它们也有助于其他遗传过程,如 DNA 测序和分析。

  它们在克隆更大基因组的完整序列的能力方面也是独一无二的,这超出了传统技术的限制。

  由于酵母细胞是真核细胞,当在原核系统中克隆时,YAC 可用于不稳定序列。

  它们由来自不同生物体的功能单元的混合物组成,但一旦插入 DNA 被克隆,它们就可以正常复制酵母染色体。

  使用 YAC 作为载体存在一些限制,因为这些会引入高度嵌合和插入重排。

  由于这些是真核细胞,因此与细菌人工染色体相比,它们难以处理并且效率较低。

  多年来创造了不同的酵母人工染色体,然后用于不同的目的。

  酵母人工染色体最常用的例子之一包括 pYAC4,它已被广泛用作克隆载体。

  人类人工染色体

  人类人工染色体是在人类细胞内充当新染色体的染色体外 DNA 片段。

  人类人工染色体的使用随着基因工程的进步而增加,因为它有助于克服通常与传统载体系统相关的问题。

  HAC 可以作为单拷贝附加体存在,而无需整合到宿主染色体中,从而允许长期稳定维持。

  此外,由于整个基因组单元可用于模拟天然基因表达,因此要掺入 HAC 的 DNA 插入片段的大小没有上限。

  尽管有许多优点,但 HAC 仅用于与人类动粒的结构和功能相关的研究。

  与 HAC 相关的限制是由于基因加载过程中的技术困难和载体结构不明确。

  2. 病毒载体

  病毒载体是基因转移修饰宿主细胞或组织并操纵它们表达不同类型基因的最有效手段之一。

  使用病毒作为载体的概念源于病毒非常有效地将其自身的遗传信息转导到宿主细胞中的事实。

  在病毒转导过程中,非必需病毒基因被具有治疗意义的外源 DNA 序列替换,以产生重组病毒载体。

  目前,已经研究了不同组的病毒是否可能用作病毒载体来传递基因以提供瞬时或永久的转基因表达。

  病毒载体的使用还可以在特定时间段内通过独特的注射技术实现位置特异性。

  考虑用于病毒载体的一些常见病毒组是腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和腺相关病毒。

  选择特定病毒作为载体取决于许多因素,包括转基因表达的效率、生产的便利性、安全性和稳定性。

  已经使用适合不同目的的不同潜在病毒载体进行了不同的临床试验。

  腺病毒已被用于在癌症治疗中转移肿瘤抑制基因,并且研究了逆转录病毒在组织修复和工程中的潜在用途。

  3. 表达载体

  表达载体是能够表达克隆基因以确定成功克隆过程的载体。

  通常,克隆载体不允许表达克隆基因,这就是需要使用表达载体的原因。

  表达载体的使用促进了原核生物中内含子的加工,因为这些内含子被设计成在调控区旁边具有限制性位点。

  载体上的限制性位点导致克隆基因的剪接以允许基因在调控系统下表达。

  表达载体中的调节系统由启动子序列、终止序列以及转录终止序列组成。

  表达载体的使用对于确定克隆程序的成功和载体上选择性标记的效率至关重要。

  表达载体可以是基于质粒或基于病毒的,它们被引入宿主细胞以编码特定的mRNA。

  表达载体通常用于生产蛋白质,然后可以根据宿主细胞的复杂性通过不同的方法对其进行可视化。

  表达载体具有不同程度的复杂性,这取决于它们是用于原核细胞还是真核细胞。

  4.穿梭载体

  穿梭载体携带来自两个不同主机的复制起点,这使它们能够在两个主机之间“穿梭”。

  这些载体包含通常可以在哺乳动物细胞和细菌细胞中复制的 DNA 质粒。

  穿梭载体用作包含来自细菌质粒和哺乳动物病毒的DNA序列的杂合载体。

  载体包含三个参与克隆过程的功能性 DNA 序列;病毒复制起点、细菌复制起点和耐药基因。

  不同复制位点和修复序列的存在使这些载体能够在细菌细胞中恢复和维持。

  根据载体使用的复制系统的类型,存在三种不同的穿梭载体。

  瞬时复制需要被大 T 抗原识别才能在人体细胞中复制的穿梭载体。

  游离型穿梭载体用于建立可以以含有 DNA 插入片段的质粒 DNA 形式永久复制的细胞系。

  整合的穿梭载体只有在与特定细胞类型融合后才能进行复制以进行基因表达。

  5. 分泌载体

  分泌载体是一种特殊的表达载体,它表达克隆的基因,以便在细胞质以外的位置产生蛋白质。

  蛋白质产物从细胞中的转运是通过插入 DNA 与编码易分泌蛋白质肽的核苷酸序列融合来实现的。

  分泌载体的使用具有产量高、纯化工艺简单、蛋白质稳定性好等优点。

  分泌载体可以设计用于不止一种类型的原核生物或真核生物,包括哺乳动物。

  将真核来源的蛋白质掺入原核宿主中的一个通常相关的问题是蛋白质的过表达。这个问题通过使用减轻包涵体形成的分泌载体来解决。

  在专注于蛋白质生产和真核 DNA 片段表达的过程中,分泌载体已经取代了克隆载体。

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