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重组DNA技术的基本步骤(重组DNA技术的应用)

发布时间:2022-01-17 10:16:48 阅读:121042次 来源:本站

  重组DNA技术是指将来自两种不同物种的 DNA 分子连接在一起,这些分子插入宿主生物体中,以产生对科学、医学、农业和工业有价值的新基因组合。

  另一方面,重组 DNA (rDNA) 是由至少两条链组合而成的一段 DNA 的总称。

  它们是通过基因重组(如分子克隆)的实验室方法形成的 DNA 分子,将来自多个来源的遗传物质汇集在一起,创造出在基因组中无法找到的序列。

  1973 年,加利福尼亚大学旧金山分校的 Herbert Boyer 和斯坦福大学的 Stanley Cohen 首次实现了生物体内的重组 DNA,他们使用 大肠杆菌 限制性内切酶将外源 DNA 插入质粒。

重组dna技术

  基因重组技术步骤

  遗传物质的分离

  rDNA 技术的第一步是以纯净形式分离所需的 DNA,即不含其他大分子。

  由于 DNA 与 RNA、多糖、蛋白质和脂质等其他大分子一起存在于细胞膜内,因此必须对其进行分离和纯化,其中涉及溶菌酶、纤维素酶、几丁质酶、核糖核酸酶、蛋白酶等酶。

  其他大分子可以用其他酶或处理方法去除。最终,加入乙醇会导致 DNA 沉淀为细线。然后将其卷出以提供纯化的 DNA。

  限制性酶消化

  限制性内切酶充当分子剪刀,在特定位置切割 DNA。这些反应被称为“限制性内切酶消化”。

  它们涉及在对特定酶最佳的条件下将纯化的 DNA 与选定的限制酶一起孵育。

  “琼脂糖凝胶电泳”技术揭示了限制酶消化的进展。

  该技术涉及在琼脂糖凝胶上耗尽 DNA。在施加电流时,带负电的 DNA 会移动到正极并根据大小被分离出来。这允许分离和切割消化的 DNA 片段。

  载体 DNA 也使用相同的程序进行处理。

  使用 PCR 扩增

  聚合酶链式反应或 PCR 是一种使用酶 - DNA 聚合酶在体外制造多个 DNA 序列拷贝的方法。

  它有助于将单个拷贝或几个拷贝的 DNA 扩增成数千到数百万个拷贝。

  PCR 反应使用以下组件在“热循环仪”上运行:

  模板 – 待扩增的 DNA

  引物——与 DNA 区域互补的小型化学合成寡核苷酸。

  酶——DNA聚合酶

  核苷酸——通过酶延伸引物所需。

  DNA 的切割片段可以使用 PCR 进行扩增,然后与切割的载体连接。

  DNA分子的连接

  用相同的限制酶切割纯化的 DNA 和目的载体。

  这为我们提供了 DNA 的切割片段和切割载体,现在是开放的。

  使用“DNA连接酶”将这两部分连接在一起的过程是“连接”。

  产生的 DNA 分子是两个 DNA 分子的混合体——感兴趣分子和载体。在遗传学术语中,这种不同 DNA 链的混合称为重组。

  因此,这种新的杂合DNA分子也被称为重组DNA分子,该技术被称为重组DNA技术

  将重组 DNA 插入宿主

  在该步骤中,重组DNA被引入主要是细菌细胞的受体宿主细胞。这个过程就是“转型”。

  细菌细胞不容易接受外来DNA。因此,他们被对待以使他们“有能力”接受新的DNA。使用的工艺可能是热冲击、Ca ++离子处理、电穿孔等。

  重组细胞的分离

  转化过程产生了转化和非转化宿主细胞的混合群体。

  选择过程仅涉及过滤转化的宿主细胞。

  为了从非重组细胞中分离重组细胞,使用质粒载体的标记基因。

  例如,PBR322质粒载体含有不同的标记基因(氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。使用pst1 RE时,它从质粒中敲除氨苄青霉素抗性基因,使重组细胞对氨苄青霉素敏感。

  重组DNA技术的应用

  重组DNA广泛用于生物技术、医学和研究。

  重组 DNA 最常见的应用是基础研究,其中该技术对生物和生物医学科学中的大多数当前工作很重要。

  重组 DNA 用于识别、定位和测序基因,并确定它们的功能。

  重组蛋白被广泛用作实验室实验中的试剂,并产生抗体探针以检查细胞和生物体内的蛋白质合成。

  在工业、食品生产、人类和兽医学、农业和生物工程中发现了重组 DNA 的许多其他实际应用。

  DNA技术也用于检测人体内是否存在艾滋病毒。

  重组 DNA 技术在农业中的应用——例如,生产 Bt-Cotton 以保护植物免受球虫的侵害。

  药物应用——DNA重组技术生产胰岛素就是一个典型的例子。

  基因疗法——它被用来尝试纠正导致遗传疾病的基因缺陷。

  临床诊断——ELISA 是可以应用重组 DNA 的一个例子。

  重组 DNA 技术的局限性

  在引入转基因物种的环境中破坏本地物种。

  理论上,弹性植物可以产生难以控制的弹性杂草。

  生物体之间专有 DNA 的交叉污染和迁移。

  污染自然环境的重组生物。

  重组生物是克隆种群,以完全相同的方式易受攻击。一种疾病或害虫可以迅速消灭整个种群。

  假设产生了超级细菌。

  关于人类试图扮演上帝并扰乱自然选择方式的伦理问题。担心未知可以使用该技术创造什么以及它将如何影响文明,这种恐惧被夸大了。

  这样的系统可能会导致人们的基因信息被盗并在未经许可的情况下使用。

  许多人担心使用重组 DNA 技术修饰食品和药品的安全性。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/732.html

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