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分子实验-免疫荧光实验方案(细胞免疫荧光步骤)

发布时间:2022-01-11 09:57:56 阅读:110672次 来源:百度学术

  细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

免疫荧光实验方案(细胞免疫荧光步骤)

  免疫荧光实验所需材料

  PBS

  多聚甲醛

  甲醇

  蒸馏水 (dh 2 O)

  PBST:1X PBS,0.1% Triton X-100。要制备 1L,将 100ml 10X PBS 添加到 900ml dH2O 中。加入 1ml Triton X-100 并混合。

  一抗

  荧光染料偶联二抗

  安装介质

  标本制备

  为了增加细胞粘附,在室温下用 1:10 稀释的聚赖氨酸溶液处理盖玻片 5 分钟。

  以适当的稀释度培养细胞并生长直到细胞达到所需的汇合度 (~70%)

  吸出介质

  在 PBS 中短暂冲洗细胞。

  固定步骤

  吸出 PBS,在 PBS 中用 2-4% 的甲醛覆盖细胞(在通风橱中工作)。让细胞在 RT 固定 15 分钟。

  吸出固定剂,在 PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。

  透化(可选)

  甲醇和丙酮固定导致透化细胞制剂。对于多聚甲醛固定的制剂,用 0.2% Triton X-100 处理 5 分钟,或者用 -20°C 甲醇处理 5 分钟。

  甲醇透化步骤:甲醛固定后,用冰冷的100%甲醇覆盖细胞(用量足以将细胞完全覆盖至3-5mm深度,不要让细胞干燥),将细胞在甲醇中冷冻10分钟。

  在 PBS 中冲洗 5 分钟。

  阻塞步骤

  注意:所有孵育均应在 RT 下进行,除非另有说明,应在潮湿的不透光盒子或有盖的盘子中进行,以防止干燥并防止荧光染料暴露在光线下。

  在 PBS、1% Triton X-100 中加入 5% 正常血清作为二抗(例如正常山羊血清、正常驴血清),将样品封闭 1 小时。(推荐的封闭缓冲液在含或不含 0.2% Tween 20 和 0.02% 叠氮化钠的 TBS (PBS) 中的 1-2% 牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白或 2% 脱脂奶粉之间变化。)

  一抗孵育

  在 PBS、0.1% Triton 中稀释一抗。典型体积为:每部分 50-100ul,每个盖玻片、腔室或孔(48 或 96 孔板)25-50ul。

  吸出封闭液,应用稀释的一抗。

  在 4°C 下轻轻摇动或摇动孵育过夜。

  在 PBS、0.1% Triton X-100 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。

  二抗孵育

  与在 PBS、0.1% Triton X-100 中稀释的荧光染料偶联二抗在室温下避光孵育 1-2 小时。(从此时起,幻灯片需要保存在黑暗中。)

  在 PBS、0.1% Triton X-100 中冲洗。

  荧光检测

  安装盖玻片。

  立即使用荧光显微镜检查或平放在 4°C 的黑暗中。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/698.html

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