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分子实验-PCR引物设计原则

2021-12-12 10:26:23
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  首先引物要跟模板紧密结合,其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在,再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则,设计引物需要考虑诸多因素,如引物长度(primer length)、产物长度(product length)、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)、错误引发位点(false priming site)、引物及产物GC 含量(composition),有时还要对引物进行修饰,如增加限制酶切点,引进突变等。

  PCR引物设计原则:

  1、引物长度一般为15-30碱基,最好在模板cDNA的保守区内设计。

  2、G+C含量在40%~60%之间。

  3、碱基要随机分布。

  4、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

  5、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

实验器材

  6、引物5′端可以修饰。

  7、引物3′端不可修饰。

  8、引物3′端要避开密码子的第3位。如果扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

  9、3’端最好不要是连续碱基,GGG或CCC会导致错误的引发。

  10、Tm值最好接近72℃,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。Tm值计算公式为:

  Tm=4(G+C)+2(A+T) (此公式试用于引物长度20mer及以下的引物)。更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为Tm=0.41(% of GC)-675/L+81.5   % of GC为引物GC含量(GC个数、引物总碱基数),L为引物碱基数。(计算公式是否附在此处。)

  11、引物5′端和中间△G值应该相对较高,而3′端△G值较低。

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