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分子实验-外泌体分离提取方法(提取方法及其优缺点解析)

2021-12-11 11:42:57
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  外泌体的文章近十年的增长速度较快,新出的流式细胞仪也开始把最低检测限瞄准外泌体这个层级,所以有必要了解一下外泌体的提取,为检测打下基础。

  外泌体都有哪些分离提取方法?

  对于外泌体研究,分离和收集外泌体是非常关键的一步。目前对于外泌体收集有:超高速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀等几种主要方法,各种方法均存在不同优缺点。

  1、差速离心

  差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。 该方法包括几个步骤,包括

  1)低速离心去除细胞和凋亡碎片,

  2)更高速离心以消除更大的囊泡,

  3)高速离心沉淀外泌体:

  不过需要注意的是,样本的粘度与分离的外泌体纯度有显著的相关性,因此,具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。

  步骤: 以300×g离心10分钟,取上清。 以2000×g离心10分钟,取上清。 10,000×g离心30分钟,取上清。 100,000×g,在4℃下持续离心90分钟,去掉上清,留下的沉淀PBS重悬后,再次以100,000×g离心90分钟。

外泌体分离

  2、密度梯度离心

  该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合,实现外泌体与非囊泡颗粒分离,例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。 因此,该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开,能够提取含量低的外泌体。 但是,合适的离心时间非常重要,否则如果它们具有相似的密度,则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 2018年Li K等人改良了此方案,回收率更高、纯度更高,并且结构和功能保持更好(Li K, Wong D, Hong K, Raffai R. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC): A Refined and High Performance Method for the Isolation, Characterization, and Use of Exosomes. Methods Mol Biol. 2018;1740:69-83[1])  3、尺寸排阻色谱

  尺寸排阻色谱(Size-exclusion chromatography,SEC)是基于大小而非分子量实现分离大分子。 该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子,分子根据其直径通过微球,半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移,而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。 尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。 此外,可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。 与离心方法相比,色谱分离已被证明具有更多优势,因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响,这可能会改变囊泡的结构。 目前,SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。 不过,该方法耗时较长,不适合大量样本处理。

  4、过滤

  超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小,从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。 最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径,可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体,也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体:

  不过,该方法由于过滤膜的粘附,可能会损失外泌体,并且过滤时的压力和剪切力,可能会使外泌体变形受损。

  5、基于聚合物的沉淀技术

  基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合,在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇(PEG)。用这种聚合物沉淀具有许多优点,包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。 然而基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物(包括脂蛋白)而且,聚合物材料的混杂可能会影响下游分析。

  6、免疫分离技术

  免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球,特异性结合外泌体。 例如使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌体。 然而,使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。

  还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面,直接分离后检测、分析、定量。最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子(ISPN)来结合外泌体,研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN,并用它们从体液中分离外泌体。

  7、通过筛分分离

  该技术利用压力或电场,通过膜从样本中筛出外泌体:

  该方法分离时间短,可以提供较高纯度的外泌体。 但是回收率低。

  怎么知道提取的外泌体合不合格?

  鉴定外泌体提取合格与否有三大法宝:电镜、NTA粒径、Western blot检测

  目前外泌体的分离提取还没有到达炉火纯青的地步,几乎没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。所以提取的外泌体需要通过三大法宝来相互佐证:形态学鉴定(电子显微镜技术)、NTA粒径分析以及Western blot检测标志蛋白(常用的有CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等)。电镜可以观察样品中是否有与外泌体相似的经典结构,有经典结构说明样品中有外泌体或者与外泌体类似的,如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构。WB检测发现样品中具有外泌体的标志物,可以一定程度上排除溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况,但依旧不知道样品的整体情况。因为电镜和WB的连用只能证明样品中有外泌体,但是有多少、纯度等就不得而知了。所以这个时候需要再来一个NTA实验,NTA粒径分析可以反应外泌体样品中粒子的群体特征,以达到跟电镜和WB相辅相成的作用。

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