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细胞实验外包-研究细胞活力和细胞凋亡的实验方案

发布时间:2021-11-29 10:18:10 阅读:17852次 来源:百度学术

  研究细胞活力和细胞凋亡的实验方案

  1、贴壁细胞:

  去除培养基并用 PBS 洗涤细胞单层

  添加解离剂(例如胰蛋白酶)并在 37°C 下孵育 5 分钟或直至细胞从细胞培养皿中分离。

  添加含血清培养基或胰蛋白酶抑制剂以灭活解离剂。

  将细胞转移到微量离心管中。

  悬浮细胞:将细胞转移到微量离心管中。

  2、通过离心(300 G,室温下 5 分钟)沉淀细胞。去除培养基并重新悬浮在含有钙离子的 PBS 或 HBSS 中。

  注意:膜联蛋白 V 需要钙才能与磷脂相互作用。用钙盐补充缓冲液,避免使用螯合剂,如 EDTA 或 EGTA。

  3、计数细胞并在每个条件下取一百万 (10 6 ) 个细胞:

  未染色样品——用于建立自发荧光水平

  用活性染料染色的样品

  用膜联蛋白 V 探针染色的样品

  用活力染料和膜联蛋白 V 探针染色的样品

细胞凋亡

  注 1:Annexin V 和活性染料必须具有不同的激发光谱才能区分它们的染色。有关多色设计实验的提示,请参阅第 4 节。

  注 2:考虑包括阳性对照样品,其中细胞用诱导细胞死亡的试剂处理,以验证所用探针的性能。

  4、添加荧光标记的膜联蛋白 V 并在室温下孵育 15 分钟。

  膜联蛋白 V 优先结合磷脂酰丝氨酸,磷脂酰丝氨酸存在于活细胞质膜的内层。在早期凋亡细胞中,磷脂酰丝氨酸易位到外层,使其易于与膜联蛋白 V 结合。

  5、通过离心(300 G,室温下 5 分钟)沉淀细胞。去除培养基并在 PBS 或 HBSS 中重悬。

  6、添加活力染料(例如碘化丙啶)并在室温下孵育 5-20 分钟。

  碘化丙啶 (PI) 是一种 DNA 嵌入剂 - 它用作与 DNA 结合的荧光染料。死细胞失去细胞膜完整性,这使得染料能够到达细胞核并与核酸结合。

  7、在流式细胞仪上分析细胞。

  注意:在分析前不要清洗细胞,以避免洗掉死细胞中积累的活力染料。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/516.html

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