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实验外包:降落PCR

2021-08-17 02:21:53
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  降落PCR简介

  降落PCR(touchdown PCR)是一种优化PCR条件的技术,一般用于在复杂模板中提高扩增特异性,但值得注意的是降落PCR无法解决扩增效率低的问题。

  我们知道从复杂的DNA模板通过PCR扩增基因会受到许多因素的影响,这些因素主要包括循环次数、Mg2+、H+、dNTP、引物和模板等。而这每一个因素对于每个PCR反应都有一个最合适的值,一般来说从一个方向改变某个数值有利于特异性提高,当这个值接近最适值时,特异产物产量会发生减少;从相反的方向改变参数值,有利于增加产量,但是特异性降低。如果想找到一个合适的PCR参数,则需要花费大量的功夫。降落PCR,对于PCR条件的优化只集中在一个参数即退火温度上,并且一个程序中可以采用不同的退火温度。

  这种技术是在1991年,有Dn最早发明的,指每一个(或n个)循环降低1(或nC)退火温度,直至达到一个较低的退火温度,这个温度称为“ touchdown”退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。据统计,正确和非正确退火温度之间的1差异将造成FR产物量的4倍差异,如果相差5,就会产生42(1024)倍的优势,因此相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的T值的15左右,在接下来的循环中,退火温度以每次12逐渐降低,直到T值以下5,当达到特异的引物模板结合的T值时,扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时,特异产物会有一个几何级数的起始优势,在剩余反应中,特异产物优先扩增,从而产生单一的占主导地位的扩增产物。这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现,尤其是当使用复杂的基因组DNA模板,非特异的退火更容易发生时。

  降落PCR中正确的产物得到富集,原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性,但也提高了引物结合的难度,降低了扩增的效率,因此一开始先用高温扩增,保证扩增的严紧性,待目的基因的丰度上升后,降低扩增的温度,提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低,无法和特异位点竞争)。

  降落PCR实验步骤

  1.实验材料:基因样品

  2.实验仪器:PCR仪

  3.实验步骤:

  ①反应体积为50 μl。

  ②人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系:CD137-pCDNA3质粒4 μl,P1,P2各0.5 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。

  ③hIgG1Fc片段的PCR扩增体系:含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl,P3、P4各0.4 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。

  ④HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系:

  (1)第一轮:HBVDNA模板4 μl,P5、P6各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U.

  (2)第二轮:取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板,P7、P8各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U。

  ⑤分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分,100℃煮沸5 min,立即冰浴5 min,加入TaqDNA聚合酶,混匀,离心,PCR程序如下:

PCR程序

 

 

  ⑥取10μl PCR扩增产物,在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察扩增产物。

  注意事项

  由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对,在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时,退火温度的范围应跨越15℃左右,从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃

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