本文主要对荧光定量PCR实验中常见问题进行分析，帮助大家理解这些问题产生的原因，从而消除疑问，得到更好的荧光定量PCR实结果。

　　1.无Ct值出现

　　答：

　　1.检测荧光信号的步骤有误: 一般SG 法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号

　　2.引物或探针降解: 可通过PAGE 电泳检测其完整性

　　3.模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起

　　4.模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况

　　2.Ct值出现过晚（Ct>38）

　　答：

　　1.扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等

　　2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足

　　3.PCR产物太长: 一般采用80-150bp 的产物长度

　　3.标准曲线线性关系不佳

　　答：

　　1.加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

　　2.标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品

　　3.引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针

　　4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高

　　4.负对照有信号

　　答：

　　1.引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现

　　2.引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比

　　3.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒

　　4.模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增

　　5.溶解曲线不止一个主峰

　　答：

　　1.引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现

　　2.引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比

　　3.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒

　　4.模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增

　　6.扩增效率低

　　答：

　　1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解

　　2.反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法

　　3.反应体系中有PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响

　　7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

　　答：

　　判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性。如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析

　　8.扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？

　　答：

　　1.参比染料设定不正确(MasterMix 不加参比染料时，选NONE)

　　2.模板的浓度太高或者降解

　　3.荧光染料的降解