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实验外包:荧光定量PCR常见问题分析

2021-08-17 03:28:04
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  本文主要对荧光定量PCR实验中常见问题进行分析,帮助大家理解这些问题产生的原因,从而消除疑问,得到更好的荧光定量PCR实结果。

  1.无Ct值出现

荧光定量pcr无CT值现象

  答:

  1.检测荧光信号的步骤有误: 一般SG 法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号

  2.引物或探针降解: 可通过PAGE 电泳检测其完整性

  3.模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起

  4.模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况

  2.Ct值出现过晚(Ct>38)

荧光定量PCR Ct值出现过晚

  答:

  1.扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等

  2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足

  3.PCR产物太长: 一般采用80-150bp 的产物长度

  3.标准曲线线性关系不佳

荧光定量PCR标准曲线线性关系不佳

  答:

  1.加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

  2.标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品

  3.引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针

  4.模板中存在抑制物,或模板浓度过高

  4.负对照有信号

荧光定量PCR负对照有信号

  答:

  1.引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现

  2.引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比

  3.镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒

  4.模板有基因组的污染:RNA 提取过程中避免基因组DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异扩增

  5.溶解曲线不止一个主峰

荧光定量PCR溶解曲线不止一个主峰

 

  答:

  1.引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现

  2.引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比

  3.镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒

  4.模板有基因组的污染:RNA 提取过程中避免基因组DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异扩增

  6.扩增效率低

荧光定量PCR扩增效率低

  答:

  1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解

  2.反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法

  3.反应体系中有PCR 反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响

  7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?

荧光定量pcr时,不同仪器同一试剂产生的不同曲线

  答:

  判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性。如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析

  8.扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?

荧光定量PCR出现

  答:

  1.参比染料设定不正确(MasterMix 不加参比染料时,选NONE)

  2.模板的浓度太高或者降解

  3.荧光染料的降解

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