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细胞实验-生物和化学诱导细胞凋亡

2021-11-27 10:13:33
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  可以通过多种方法在实验系统中诱导细胞凋亡。一般来说,诱导细胞凋亡的方法可分为生物诱导和化学诱导两大类。

  细胞凋亡诱导生物

  Fas或 TNF 受体通过各自的配体激活,或通过与激动剂抗体交联,诱导携带 Fas 或 TNF 受体的细胞凋亡。在这里,我们描述了在 Jurkat 细胞中使用抗 Fas 受体(抗 CD95)单克隆抗体(mAb)诱导细胞凋亡的一般协议。小鼠单克隆抗 Fas 抗体 [UT-1] (ab11881)可用于细胞凋亡指示。

  1、在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI-1640 中,在 37°C的加湿 5% CO 2培养箱中培养 Jurkat 细胞。

  2、通过以 300–350 xg 离心5 分钟,以 10 5细胞/mL的浓度收获呈指数生长的细胞。将新鲜培养基中的细胞重悬至最终浓度为 5 x 10 5细胞/mL。

  3、添加 anti-Fas (anti-CD95) mAb 至适当浓度(对于 ab11881,使用终浓度为 2-20 mg/mL。在 37°C 培养箱中孵育 2-4 小时。对于阴性对照,孵育未处理的细胞(不含抗 Fas/CD95 抗体)在相同条件下。

  4、以 300–350 xg 离心5 分钟收获细胞。

  5、去除所有培养基并在 PBS 中重悬细胞。

  6、重复离心步骤并将 PBS 中的细胞重悬至 1.5 x 10 6细胞/mL。

  7、继续使用您选择的方法检测细胞凋亡。

  化学诱导细胞凋亡

  凋亡诱导剂作用于几种凋亡相关蛋白以促进凋亡细胞死亡。根据选择的药剂和使用的浓度,可以在治疗后 8-72 小时之间检测到细胞凋亡事件。然而,并非所有试剂都会以相同的方式影响特定的细胞系。

  这些是使用会导致细胞凋亡的化学试剂诱导细胞损伤的一般指南。

  1、设置用于治疗的细胞:将贴壁细胞接种到 10 cm 2组织培养皿中或将悬浮细胞以 ~10 6细胞/mL的浓度接种到 T75 烧瓶中。根据需要准备尽可能多的样品,以确保您可以在相关时间检测到细胞凋亡的诱导。一个培养皿/烧瓶将用作非诱导细胞的阴性对照。

  2、添加推荐浓度的细胞损伤剂以诱导细胞凋亡。

  例如,下表列出了可用于通过依赖 p53 的 G1 期阻滞诱导细胞凋亡的细胞损伤剂的最终浓度:

化学诱导细胞凋亡


  在阴性对照中加入适量的缓冲液或溶剂。

  作为进一步的控制,可以包括不同途径的抑制剂:

  3、在加入细胞损伤剂后,在不同时间(即 8、12、16、24、48、72 小时)收获细胞。

  4、对于细胞凋亡检测: 收集细胞并使用您选择的方法检测细胞凋亡。

  5、查凋亡蛋白: 收集所有细胞。使用您选择的方法制备用于蛋白质印迹检测或免疫沉淀的细胞裂解物。始终将凋亡蛋白的水平与对照处理的细胞进行比较以确认诱导。

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