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细胞实验:细胞免疫荧光实验怎么做?

2021-08-19 03:27:03
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  细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位,以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化,那么细胞免疫荧光实验怎么做呢?

  在进行细胞免疫荧光过程中,需要用到细胞爬片,通过将爬片浸在细胞培养基内,细胞在爬片上生长,进而进行细胞的免疫荧光。

  实验前准备:

  1.胰酶

  2.DMEM细胞培养基

  3.细胞培养12孔板或者6孔板

  4.爬片

  实验步骤:

  1.细胞种板与细胞爬片制备:

  1) 细胞密度在90%-95%左右,用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中,充分吹打,使之成单细胞悬液,计数。

  2)取细胞培养12孔板,在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基,然后将爬片置于液滴上,压紧,使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,防止加细胞悬液时爬片漂起,造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。

  3)24h或者48h后,根据细胞生长速度快慢,观察判断细胞密度,约90%时进行细胞免疫荧光。

 

细胞免疫荧光

  2.细胞的固定及免疫荧光

  1)吸除培养基,一般先加入PBS浸洗细胞 3 次,每次 5 min。

  2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml,进行细胞固定,室温固定20分钟。

  3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。

  4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min,目的是使细胞通透。

  5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。

  6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时(选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致)。封闭后不需要用PBS清洗。

  7)吸去封闭液,向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗(第一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度,后续实验可以摸索抗体的适宜浓度),4℃湿盒内孵育过夜。

  8)吸去一抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。

  9)向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗,37℃,室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记,因此操作过程尽量在暗处进行。

  10)吸去二抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。

  11)向玻片上滴加DAPI,或者Hoechst复染细胞核,一般为蓝色荧光;避光孵育5-10min。

  12)使用PBS轻洗细胞3 次,每次 5 min,洗去多余的DAPI。

  13)取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧,张力较大,可将注射器针头针尖向背面做个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出即可。

  14)用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上,然后在荧光显微镜下观察并采集图像,注意选择抗体对应的激发光源。

  注意事项:

  (1)取细胞爬片时,动作应轻柔,防止将细胞爬片夹碎,影响实验进程。

  (2)种细胞过程中,要注意将细胞轻柔混匀,“八”字或者“十”字形摇晃,防止细胞局部生长过密。

  (3)稀释、加二抗(荧光抗体)及此后的洗涤过程中注意避光。

  (4)细胞爬片进行免疫荧光之后,需要尽快拍照,防止免疫荧光淬灭。或者放于暗盒内,暂时保存于4度冰箱,尽快拍照。

  (5)在进行荧光显微镜拍照时,要根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色,只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光

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