这次给大家带来的分享内容是有关于大肠杆菌转化实验的，接下来会分享热击法和高效率电转化法这两种，觉得有用的小伙伴可以收起来。

　　第一种：热击法

　　实验方法原理：质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42摄氏度短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

　　实验材料：质粒DNA、重组DNA

　　试剂、试剂盒：LB培养基、蒸馏水、IPTG、X-gal、氨苄青霉素

　　仪器、耗材：旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、离心管、双面微量离心管架、干式恒温气浴、恒温水浴锅、制冰机、恒温摇床、培养皿、超净工作台、酒精灯、玻璃涂棒、恒温培养箱

　　实验步骤：

　　实验材料准备

　　1. 器材

　　旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，培养皿(已铺好固体LB-Amp)，超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

　　2. 试剂

　　培养基(不加抗菌素)，LB培养基(加抗菌素)，无菌ddH2O，IPTG，X-gal。

　　3. 材料处理

　　无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)，20%IPTG(M/V)，2% X-gal(M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配)。

　　操作步骤

　　1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

　　2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 ul)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

　　3. 加入5 ul 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng)，轻轻震荡后放置冰上20 min。

　　4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。

　　5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 ul LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

　　6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 ul，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

　　7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal，8 ul 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

　　8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

　　9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

　　10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

　　注意事项：

　　1. 电击之前保持低温状态。

　　2.电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20℃冰箱存放。

　　3.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂。

　　第二种：高效率电转化法

　　实验材料：大肠杆菌

　　试剂、试剂盒：LBSOC

　　仪器、耗材：电转化仪、离心机、分光光度计

　　实验步骤：

　　1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养液，37℃温和振摇培养5 h 或过夜。

　　2. 将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中，37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。

　　3. 细菌在冰水浴冷却10~15 min，然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃，5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。

　　4. 加入500 ml 冰冷的水，混匀，按步骤3重复离心1次，立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。

　　5. 新鲜制得的细菌

　　(1)将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中，2℃，5000g 离心10min。

　　(2)估计细胞沉淀的体积，沉淀用等体积的冰冷水重悬。

　　(3)按50~300ul 分装于预冷的微量离心管中。

　　6. 冻存细菌

　　(1)加入40 ml 冰冷的10%甘油，混合，然后按照步骤5离心。

　　(2)估计沉淀的体积，然后加入等体积的冰冷的10%甘油，重悬菌体。

　　(3)按50~300ul 分装于预冷的微量离心管中。

　　(4)于干冰上冷冻并贮存于-80℃。

　　7. 将电转化仪调到2.5 kV、 25 uF ，脉冲控制器调到200~400Ω;。

　　8. 将1 ul 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中，混匀。

　　9. 将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。

　　10. 进行脉冲电转化，然后取出电转化池，马上加入1 ml SOC培养液，并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。

　　11. 于37℃，中速振荡培养30~60 min。

　　12. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。