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病理实验:慢病毒滴度有哪些检测方法?

2021-08-18 02:10:44
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  慢病毒滴度值是用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量,所谓病毒滴度即每升溶液中含有的病毒数量。转导单位(TU)即能够感染并整合到细胞内的病毒载体基因组。常规生产的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之间。

  下面我们就来聊下几种常见的慢病毒载体滴度的检测方法。传统的慢病毒包装效率检测方法有ELISA法(检测P24蛋白)和Real-time PCR法(检测核酸拷贝数),最近又有了基于胶体金层析技术的半定量检测卡。我们一一介绍。

  ELISA法检测病毒滴度

  当通过纯化获得重组慢病毒颗粒后,需要对慢病毒液的浓度或感染活性进行定量检测。一般来说,对于病毒颗粒进行定量主要是通过检测纯化的病毒液中DNA的OD260来检测其病毒含量(Quantitation);而对于病毒颗粒的滴度检测(Titer),则需要通过传统的克隆成斑试验或者对病毒特异蛋白的免疫反应试验等检测,如:慢病毒外壳蛋白p24的免疫学ELISA方案。p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白。基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分两种,一种称为传统的p24蛋白ELISA检测(Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)),能检测所有p24蛋白,从而实现对病毒滴度的定量。分为一次96孔板分析和五次96孔板分析,采用ELISA方法,反应灵敏,可检测1 ng/mL HIV p24蛋白,最后分光光度计读取数据。由于病毒颗粒的外壳蛋白p24蛋白是由包装细胞系提供的,因此在使用检测的时候不可避免的会将病毒颗粒本身的p24蛋白与包装细胞系产生的p24蛋白一起检测,造成实验的误差,而较新的Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分离出包装细胞产生的游离p24蛋白,只检测病毒颗粒表面的p24,因此实验数据更真实准确。分为一次96孔板分析和五次96孔板分析,采用ELISA方法,反应灵敏,可检测1 ng /mL HIV p24蛋白,最后分光光度计读取数据。

  Real-time PCR法检测病毒滴度

  慢病毒感染靶细胞的感染效率可以通过Real-time PCR检测靶细胞中的慢病毒载体拷贝数来测算。所谓Real-Time PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。real-time PCR技术即实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因芯片,siRNA干扰的实验结果。

  胶体金检测卡检测病毒滴度

  基于胶体金层析技术的慢病毒载体滴度半定量快速检测卡可用于慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估。在一定的检测范围内,检测线颜色的深浅与P24浓度呈正相关,通过比色卡比较,可以半定量待检样品中P24浓度,并大致估算慢病毒滴度。

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