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实验外包:质粒提取方法有哪些?

发布时间:2021-10-13 05:44:17 阅读:16652次 来源:本站

  质粒提取目的:质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值,要想从细中获得质粒DNA,需要通过质粒提取的方法。

  质粒提取的方法

  质粒提取主要有碱裂解法,煮沸裂解法,小量一步提取法等。

  1、碱裂解法原理:根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下,细菌的细胞壁和细胞膜被破坏,基因组DNA和质粒DNA被释放出来,线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性,但两条互补链仍会互相盘绕,并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时,共价闭合环状质粒DNA复性快,而线性的染色体DNA复性缓慢,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

  2、煮沸法裂解:将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性。但是,闭环质粒DNA彼此不会分离,这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构,当温度下降后,闭环DNA的碱基又各自就位,形成超螺旋分子,离心除去变性的染色体核蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制备),多至250mL(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。

  3、小量一步提取法:由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上,并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性,机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快,仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢,会形成不溶的网状结构,通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

实验外包

  质粒提取方法选择

  质粒提取的方法主要根据质粒DNA分子量的大小,所用细菌的种属,细菌裂解释放DNA后的纯化方法和实验要求来选择。

  1、质粒DNA的分子大于15kb时,在质粒抽提过程中容易受损,可以采用比较温和的裂解方法,将细菌悬浮于等渗的葡萄糖溶液中,加入溶菌酶和EDTA破坏细胞壁和细胞膜,这样可以缓解高渗透压的细菌在释放质粒DNA时的压力,保护质粒DNA。

  2、小分子的质粒DNA可以选用相对剧烈的方法来分离DNA。可以用煮沸法,碱裂解法或者加入溶菌酶,EDTA和去垢剂裂解细菌。这些方法会使DNA变性,但两条互补链仍会互相盘绕,并紧密的结合在一起,在恢复正常条件后,DNA便会复性。

  3、对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用煮沸法。而这些碳水化合物在密度梯度中会紧靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的区带,因此很难避免,而这些碳水化合物可抑制多种限制酶的活性。这类菌株制备质粒时,不宜采用煮沸法。

  4、菌株含有限制性核酸内切酶A的不宜使用煮沸法。因为煮沸不能使内切酶A完全失活,在后续实验中再用限制性内切酶消化时,质粒DNA会被降解。此时必须用酚:氯仿进行抽提。

  煮沸法时间短,(特点) 操作简单,时间短;(缺点)条件过于剧烈,易造成质粒断裂,回收率较低。

  碱裂解法操作简单,(特点) 所得质粒量较多且污染少,(缺点)花费的时间较长。

  质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒 )步骤如下:

  1、挑菌:选取培养板中大小中等的单个菌落,消毒牙签接种到 10ml 摇菌管中,其中含有卡那霉素的 LB 约5ml ,37 °C,220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。

  2、取上述 2.0ml培养液,于常温下 12000 rpm离心1分钟,弃上清,干燥沉淀。

  3、 加入250μl溶液P1(配有去 RNA 酶,4 °C保存),涡旋振荡, 完全悬浮细菌,不能留有沉淀,否则会影响裂解。

  4、 加入 250μl溶液P2,快速上下颠倒 8次,常温静置 3分钟,可见混合液逐渐变清、粘稠,表示已充分裂解。

  5、再加入350 μl溶液Ⅲ,快速上下颠倒 8次,可见白色絮状物出现。

  6、 常温12000rpm离心10分钟,所得上清液倒入已经用 BL平衡过的过滤柱中, 注意不要倒入白色絮状物沉淀,静置 3分钟, 12000 rpm离心1分钟。

  7、 加入 500 μl 溶液PD,12000 rpm离心1分钟。

  8、 加入 600 μl 溶液PW,12000 rpm离心1分钟;此步骤再重复 1次;弃废液后空管再次 12000 rpm离心2分钟。

  9、于超净台通风干燥,放置 2-5分钟,加入 33μl 已加热至 65 °C的已灭菌的 ddH2O,室温静置 3分钟, 12000 rpm离心2分钟,得到相关质粒 DNA ,测浓度, -20 C°保存备用。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/402.html

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