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实验外包:Western Blot实验的原理和步骤

发布时间:2021-08-17 07:24:58 阅读:18042次 来源:本站

  Western Blot(WB)是一项很基础的实验,但却是很多同学心中的痛,对于基础的WB实验,我们必须掌握,下面我就从原理和步骤说起教大家如何做Western Blot实验。当然,没时间做实验的同学也可以选择Western Blot服务

  Western Blot实验原理

  Western Blot是一种非常经典的定性、定量检测蛋白表达的方法。其原理通俗来说:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质是被检测物,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

  Western Blot实验步骤

  1. 蛋白样品提取

  既然是测蛋白,那么我们首先要做的自然就是提取蛋白。可按如下步骤进行:

  a) 若样品为细胞样品,而且是贴壁细胞(细胞数量一般保证在1×106~1×107)然后用预冷的PBS洗2~3次,之后加入含PMFS的强RIPA裂解液(约300ul),将细胞刮下,储存在离心管中;若为悬浮细胞,则先离心,去除上层培养液,再用预冷的PBS重悬,离心,重复操作2~3次,之后再加入RIPA裂解液,储存在离心管中;

  b) 若样品为动物组织,我们先可以取适量(250~500mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml含PMFS的强RIPA裂解液,用电动匀浆器进行破碎匀浆;

  c) 不管是哪一类型的样本,这一步就要将加入裂解液后收集的样品,置冰上,裂解20~30min;

  Tips:中间可以颠倒混匀数次,主要需要裂解完全

  d) 接下来就是离心,我们选择4℃,12000转,离心10min;

  Tips:离心机可以提前预冷至4℃

  e) 最后,在离心后取上清,即为提取的总蛋白。

  2. 蛋白浓度测定

  蛋白提取出来了,现在我们来测定蛋白浓度,按照BCA法测定蛋白浓度。方法如下:

  1.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中,充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用,也可以-20℃长期保存。

  2.取适量25mg/ml蛋白标准,稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白标准,加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。

  3.根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。例如5mlBCA试剂A加100μlBCA试剂B混匀,配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

  4.将标准品按0, 1, 2, 4, 8,12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液补足到20ul。

  5.加适当体积样品到96孔板的样品孔中,加标准品稀释液到20μl。

  6.各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30分钟。

  (注:也可以室温放置2小时,或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育,或适当延长孵育时间)

  7.测定A562nm波长,540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

  3. 电泳

  前面的工作做完了,终于到了实验的重头戏:电泳。电泳时需要设计好加样顺序,做好实验记录,按照预定顺序加样。我们来看一下具体操作流程。

  1)清洗玻璃板

  蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用,需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来,玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应用水洗干净,临用前用无水乙醇擦拭晾干。

  2)灌胶与上样

  ① 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作前先往玻璃板间灌水,检查是否漏)。

  ② 按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置,最后加入 TEMED,之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀,此外应保证试剂的新鲜,特别是过硫酸铵。

  灌胶时掌握好速度,避免气泡产生(注意浓度越小的胶含水越多,凝固后胶体积缩小越多)。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变形)。

  未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡。注意给积层胶留出足够的空间(分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加 1 cm)。

  ③ 当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定,通常在 30 min 左右,AP 不新鲜会导致聚合变慢,气温较低时胶是会凝得慢一些,必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量,但通常不会超过 1 h,若超过 1 h 甚至更长仍未聚合,应检查配制的操作有无错误。

  由于 TEMED 催化 APS 释放相关化学基团,再由 APS 释放的基团催化 Acr/Bis 聚合,所以如果 APS 不新鲜的话加再多的 TEMED 效果也不佳,这就是为什么推荐 APS 每周新鲜配置的原因。

  ④ 按说明书配积层胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。

  由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

  ⑤ 趁积层胶聚合的这段时间,取适当体积样本混合 1X SDS loading buffer(最好事前分装好,每次从冰箱里取一管即可),95~100° 加热 5 min,若有沉淀可用稍低温度,比如 45~55° 加热 1 h 达到变性的目的。我一般习惯分装 20 ul 到 PCR 管里,先和 loading buffer 混合好,临用前用 PCR 仪加热 95 °C 5 min,效果不错。

  ⑥ 胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上,加入电泳缓冲液后开始准备上样。加样前可用 5 ml 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。用微量加样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次,以免交叉污染。

  目前我们做的 mini 胶上有 10 个上样孔,一般在第一个孔加入 marker(我用的是 Fermentas 预染 marker),其余 9 个孔加入样品,也可在头尾孔内加入 marker,中间 8 个孔加样品。加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品。在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用 10 ul 的枪头就行,比用微量加样器快很多,用枪头时注意不要插得太深,容易把玻璃板撑开,样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。

  3)电泳

  电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,网上有资料建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通,但是在《分子克隆》上却反对这种做法,理由是会破坏缓冲系统 pH 的不连续性。

  Tips:其实大家按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。

  电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。

  4. 转膜(Transfer)

  在跑胶时就可以准备转膜用品,最主要赶气泡。我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90 kd 以下的蛋白,转膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037% 的 SDS。

  1)剪PVDF膜,并提前切个角,甲醇中泡30s。

  2)将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中保存。

  Tips:转膜液可回收。

  3):将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上,并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,合起夹子。

  Tips:整个操作在1*转膜液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。

  4)将夹子放入转膜槽槽中,黑对黑,红对红。电转移时会产热,过热有可能造成蛋白质的降解,同时大量产热,会使凝胶膨胀,有可能在胶和膜之间产生空隙,引起转膜不均匀,所以在转膜槽外放冰盒,在冰水混合物中进行转膜。

  Tips:转膜条件是电流200mA或电压110V,2h;另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V,调节电流。

  5)转完后将膜放入装水的小盒中冲洗,倒水后,加5%的封闭液,摇床封闭2h。 防止产生高背景信号,封闭是利用利用脱脂奶粉或 BSA。

  5. 免疫反应及数据分析

  1)回收封闭液,加入一抗,摇床4℃过夜。

  2)一抗孵育。配置特定浓度的一抗稀释液,与膜进行孵育, 一抗会与膜上目的蛋白进行特异性结合。

  3)一抗孵育结束后,与特定浓度的二抗进行孵育结合。二抗带 HRP或 AP标记。

  4)二抗回收,用PBST洗,洗5次,每次5min。(少时多次)

  5)化学发光显影,曝光/成像。纯水冲洗5-7次,倒掉纯水,加化学发光,膜在化学发光中浸泡2-3min,成像。曝光成像后,将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

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