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细胞转染实验方法指南(细胞转染实验步骤)

发布时间:2022-02-18 10:31:42 阅读:111672次 来源:百度学术

  常见的细胞转染方法大致可分为三种:化学转染法、物理转染法以及病毒转染法。这几种方法也是各有千秋,学会根据自己的实验选择合适的方法才能更容易得到理想的实验结果。今天,我们就来一起了解下这些方法的大致步骤流程,并详细的介绍一些比较经典的转染方法步骤。

  细胞转染方法有哪些?

  化学转染法

  DEAE葡聚糖法

  磷酸钙法

  人工脂质体法

  物理转染法

  显微注射法

  电穿孔法

  基因枪法

  病毒转染法

  逆转录病毒

  腺病毒

  今天我们主要和大家介绍其中一些很经典的方法。

  1.DEAE-右旋糖苷法

  常言道:同性相斥,异性相吸。因而,当带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸中带负电的磷酸骨架相遇,妥妥的火花四射,而后会被细胞膜抱团相拥并通过细胞内吞作用迎客到家。该法可用于瞬时转染,操作相对简单、结果可重复,但是对细胞有一定的毒副作用,且转染时需要血清。

  DEAE右旋糖酐介导转染的工作流程:

  1.将核酸与DEAE-右旋糖酐在转染培养基在磷酸盐缓冲液中混合

  2.形成核酸-DEAE-右旋糖酐复合物

  3.将复合物加入细胞内,并通过经典作用粘附在细胞表明

  4.用DMSO或甘油形成渗透压休克,诱导细胞对复合物的内吞

  5.清洗细胞并孵育,分析细胞瞬时基因表达

  2.磷酸钙法

  通常穿了“隐身衣”核酸分子在“照妖镜”磷酸钙的作用下可形成“肉眼可见”的磷酸钙-DNA共沉淀,可使共沉淀中浓缩DNA分子与细胞表面结合并通过内吞作用进入细胞。该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感,所得结果容易出现差异,且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性,转染效率较差。

  磷酸钙共沉淀的工作流程:

  1.将核酸与氯化钙在磷酸盐的缓冲液中混合,同时控制好温度和PH等

  2.室温孵育,生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀

  3.将颗粒型沉淀分散到细胞中,促进DNA粘附在细胞表面

  4.共沉淀通过内吞作用进入包浆

  5.分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性转染

  3.人工脂质体法

  带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞,转染效率高、重复型好,但转染时需要去除血清,转染效果随细胞类型变化大。

  人工脂质体介导转染的工作流程:

  1.在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂

  2.脂质体与核酸的磷酸骨架结合,形成复合物

  3.脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合

  4.复合物通过内吞作用进入包浆

  5.分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性转染

  4.电穿孔法

  有时,细胞有些“油盐不进”,就是不开放门户给核酸放行,此时各位小伙伴可采用一些强硬手段—电穿孔法。此法利用高脉冲电压破坏细胞膜电位,使得DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定/瞬时性转染,适用于所有类型的细胞,但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,且需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。

  其他物理基因输送法还包括基因枪、直接显微注射等方式。前者又称为粒子轰击,可将包裹着核酸的显微重金属颗粒告诉射入受体细胞内,适用于瞬时性转染。该技术可需要昂贵的设备,且细胞死亡率较高。而后者则是通过精细的注射针将核酸送入胞浆中,一次只能输送一个细胞中,适用于构建转基因动物或输送人工染色体。

  电穿孔的工作流程:

  1.将细胞悬浮于电穿孔缓冲液中,制备细胞

  2.在特定缓冲液存在的条件下,对细胞施加电脉冲

  3.电脉冲子细胞膜上形成电势差,形成临时孔,以便核酸进入细胞内

  4.使细胞恢复生长状态,复苏细胞

  5.分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性转染

  5.病毒转导法

  一般,病毒介导的转染也称之为转导,它为难以转染的细胞类型提供了一种方法,可用于蛋白质过表达或抑制,是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中,可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。

  病毒转导的工作流程:

  1.通过基因克隆生成重组病毒

  2.采用非病毒法转染包装细胞系,扩增并分离病毒载体

  3.纯化并滴定含有转基因的病毒载体

  4.以适当的感染复数感染目的细胞(含有病毒特异性受体)

  5.去除培养物中的病毒,并加入新鲜培养基

  6.分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性转染

  细胞转染方法步骤(脂质体)  

  1.转染前

  首先,准备细胞、质粒和实验所需试剂。细胞最好取实验室里已经验证的易转染细胞株,如COS-1/Hela/CHO-K1细胞,同时实验前要重新复苏一株低传代细胞来确保该细胞株未被其他细胞和微生物污染。

  选择表达质粒载体如β-gal载体,GFP载体等时,要先确保该质粒能在所选的细胞系中表达良好。同时质粒纯化时要注意纯化过程中勿使双链断裂以及无核酸酶和内毒素污染。

  同时准备新鲜的培养基,使用前用0.22um滤膜过滤培养基来确保培养基无污染。细胞培养过程中勿加抗生素,且需要不断监测细胞的生长情况。当细胞密度达到50-80%时,可用于细胞转染。

  2.转染中

  首先,由于不同质粒和脂质体的最佳搭配比例不同,转染前应该做预实验来摸索一个最佳配比。作预实验时,按照质粒:脂质体=1:1、1:2、1:3、1:4的梯度来检测最佳转染比例,如下表所示。

细胞转染

  转染复合物制备时间15分钟孵育20分钟孵育25分钟孵育30分钟孵育

  同时也需要设立对照实验,如试剂对照:仅加入转染试剂,可确定转染试剂对细胞毒性。DNA对照:仅加入DNA,确定制备DNA的质量是否对细胞存在影响。空白对照:用空载体制备转染试剂复合物(建议3:1的比例),确定转染后细胞生理或功能的变化是源于目标基因,还是源于转染过程本身。

  其次,在正式实验中,需要小心轻柔将lipo2000加到培养基中并轻轻混匀,避免暴力吹打,使得脂质体失效。转染时各种培养皿添加的质粒和脂质体参考量见下表:

各种培养皿添加的质粒和脂质体参考量

  3.转染后

  首先,转染24h后需要观察转染过程对细胞毒性情况,如果毒性较高,可能是由以下原因造成的:

  1.初期细胞接种浓度太低

  2.转染复合物加入量过高,因为不同细胞对转染的敏感度不同

  3.转染后6小时需更换培养基,一是lipo2000具有一定毒性,二是培养基需要更换成有血清培养基。

  其次,转染后需要对转染效率进行检测,比如观察转染后细胞荧光情况、qPCR验证或WB检测敲减或者过表达蛋白。

  4.对于β-gal表达载体:可用β-gal染色试剂盒进行细胞染色并观察细胞。转染效率高的细胞在染色孵育后3-4h即可观察到,转染效率低的细胞则需要更长的孵育时间。

  5.对于GFP表达载体:荧光显微镜下观察细胞。如果细胞能在显微镜下被观察到,至少需要有104-105拷贝的GFP蛋白表达,表达太弱的细胞无法镜检。GFP表达情况也能使用流式细胞仪进行检测,同时可加入PI进行染色以监测死细胞情况。

  最后,若是转染后发现转染效率不高,可以通过两种方法增强转染效率。

  (1)复转染,即转染后12-24小时再次进行转染,前提是该细胞对脂质体的耐受性较好,转染后细胞死亡数较少。

  (2)通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。


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