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细胞培养全指南(多年实战经验汇总,绝对干货)

发布时间:2022-05-07 10:38:34 阅读:16262次 来源:百度学术

  本文技术干货:

  1.细胞培养、传代、冻存和复苏步骤。

  2.污染防治。

  3.细胞培养常见问题解答。

  一、

  培养、传代、冻存和复苏

  01

  准备工作:

  根据培养细胞的特性,提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件,以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时,充分了解到细胞的生长特性和形态特征,便于后续的培养观察。

  PS:一般我们这边(广州赛库)提供出去的细胞为方便运输都是灌满培养基,但血清浓度只有5%,以免运输中过度生长,所以收到细胞后记得补加血清。

  02

  贴壁细胞传代:

贴壁细胞传代

  1)移弃使用过的细胞培养液。(不要直接倒掉,避免瓶口残留导致易污染)

  2)使用不含钙镁离子的平衡盐溶液(PBS)冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液,以避免搅动细胞层,前后摇晃容器数次,最后移弃冲洗液。(洗去残留的血清,避免影响胰酶的活性。)

  3)以 25 cm2的培养瓶为例,向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA(请根据各细胞的指引使用合适的浓度)消化液,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,几分钟内,会发现胞质回缩、细胞间隙增大,倾斜培养瓶时细胞层能自然流下,此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化(细胞解离所需时间请参考各细胞的指引,并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况)。另,并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离,请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

  PS:我们这边(广州赛库)出去的细胞,一般会根据我们的经验备注消化时间和条件,给大家提供参考。

  4)使培养瓶倾斜,吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面,重复该动作2-3次,使所有细胞沿瓶底流下,再轻柔地把细胞吹打成单个悬液(吹打过程中应避免气泡的产生)。

  PS:对于难消化的细胞,尽量不要通过用力吹打的方式来处理,以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来,及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化,避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

  5)把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

  6)加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,补足新的含血清完全培养液,轻轻摇晃混匀。

  7)放到37 ℃ 孵育,第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

  03

  悬浮细胞传代:

悬浮细胞传代

  因悬浮生长细胞不贴壁,故传代时不必采用酶消化方法,而可直接传代或离心收集细胞后传代。

  1)直接传代时,静置5-10分钟,待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培养液,补足新鲜的含血清完全培养液,混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,轻轻摇晃混匀。

  2)离心传代时,将细胞连同培养液一并转移到离心管内,800-1000rpm离心3-5分钟,移弃上清后,加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,补足新鲜的含血清完全培养液,轻轻摇晃混匀。

  3)放到37 ℃ 孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。

  04

  贴壁悬浮混合型细胞传代:

贴壁悬浮混合型细胞传代

  先将悬浮的细胞收集,再参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集,一起接种到培养器皿中。

  PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高,培养中最好参考指南控制好细胞密度,不能过密也不能过稀。

  05

  细胞冻存:

  1)按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。

  2)加入细胞冻存液(一般10%DMSO+对应细胞的完全培养液),使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml,移入细胞冻存管中。

  3)程序降温(以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例):4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否则冻存液无法渗透到细胞,易产生冰晶导致细胞受损。)

  06

  细胞复苏:

  1)取出贮存的细胞,待液氮挥发后,马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化(通常2min内,时间长了细胞状态会受影响)。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂,操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。

  PS:干冰运输的冻存细胞,收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中,至少3d后再进行复苏操作。

  2)转移到无菌操作台,75%酒精擦拭冻存管外部。

  3)将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清完全培养液离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟,移弃上清。

  4)重新加入经预热的含血清完全培养液重悬细胞,以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。

  5)放到37℃孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。

  二、

  污染防治

  01

  细菌污染

细菌污染

  细菌污染是细胞培养中最常见的污染,主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。

  左边的就是比较典型的杆菌污染,一般杆菌会延轴向快速游动,量少时培养基澄清。右图是颗粒状污染,一般培养基会浑浊或有白色沙状沉淀。

  好氧菌增殖分裂迅速,感染24h内即可使培养基浑浊;厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢,需要较长时间才会观察到浑浊现象。

  污染处理:由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥,所以出现污染后加双抗(青霉素&链霉素,Penicillin + Streptomycin)一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周,颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周,效果相对还不错。

  02

  真菌污染

真菌污染

  细胞培养中最常见的污染真菌有:烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

  左边这张是比较典型的霉菌污染的图片,右图是酵母污染,镜下可以看到明显的出芽形态。

  污染处理:可用100ug两性霉素B/T25瓶,处理一周。

  注:两性霉素毒性较大,需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。

  03

  支原体污染

  支原体的危害:支原体污染可以改变细胞的特性。例如部分支原体会快速消耗培养液中的精氨酸,与细胞竞争营养,从而使细胞的生长速度减慢或停止;同时支原体还可以改变细胞的酶谱、细胞膜成分,造成细胞染色体异常或细胞病理性改变等。上述情况会严重影响到使用这些细胞所做实验的结果,导致结论不可靠。

PCR法检测细胞上清中的支原体污染

(PCR法检测细胞上清中的支原体污染)

  支原体的预防与清除:由于支原体无法在镜下直接看到,需要通过PCR法等进行检测才发现,出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检,做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检,直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理,优先处理“支原体阴性”细胞,后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。同时,新引进的细胞系都进行支原体检测,确保不给实验室带来新的污染。

  04

  实验室细胞污染防治

  建立良好的规章制度对减少细胞污染会有很大的帮助。包括准入制度、操作规范和日常管理制度。

  准入制度:包括了人员的和物料的。人员需要进行培训之后才能自己进行操作,而且要符合穿戴要求才能进实验室,如白大褂、隔离服,口罩,手套等。而所需用到的物品,非一次性的物品应严格消毒灭菌,而购买的物品需要从正规的、可靠的渠道购买。新买的细胞应检测验证后再使用。

  操作规范:对于常规操作最好制定规范,且实验室人员都要按操作规范进行,不能随意更改,同时也是培养实验人员的良好操作习惯。比如,枪头滴管吸完就不再二次伸入培养基中吸取,一次吸够足够量的培养基。加液时也应尽量做到悬空加液,这些都可有效预防支原体污染和细胞交叉污染。另外可以的话,一次只操作一株细胞,细胞与细胞间最好有一点时间间隔,避免交叉污染。

  日常管理制度:则包括环境及耗材试剂等的使用、清洁、保养等各方面的规则、方法。还有试剂耗材等的用量、库存及采购等的管理,包括细胞样品的两级库存管理。对于不易发现的污染源,最好定期进行检测,主要是支原体污染和细胞交叉污染。

  三、

  细胞培养常见问题汇总

  Q:培养液到底要不要加双抗(青霉素&链霉素,Penicillin + Streptomycin)?

  A:双抗不是细胞生长必需的。我们培养细胞时不常规使用抗生素,因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生,导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养液中去除,这种轻度污染最终将发展成大规模污染。

  请根据各自实验室的环境情况,自行决定是否使用双抗。

  Q:能更换成其它种类的培养液吗?

  A:我们强烈建议使用细胞提供机构或细胞库推荐的生长培养液。另,有些细胞可能适合在不同培养液里生长,在做好保种或有细胞维持在原推荐培养条件下,可分出部分细胞做测试。

  Q:细胞在培养过程中出现碎片如何处理?

  A:贴壁细胞在移除原培养液后,用PBS液冲洗2-3遍;悬浮细胞离心移除原培养液后,加入PBS重悬,离心移除PBS;一般建议重复上述步骤2-3遍,800-1000rpm离心3-5分钟。

  Q:细胞能放在-80℃保存吗?

  A:长期保存的细胞应在液氮(-196℃)存放,短时间(一般1-2周)可以存放在-80℃。

  Q:培养瓶是用密闭盖好,还是透气盖好?

  A:都可以。只是在使用密闭盖培养瓶时,瓶盖旋进约2/3,预留约1/3以便细胞进行气体交换;或部分品牌的密闭盖培养瓶的瓶盖上有合适位置指示标志。

  Q:L-15培养基不需要二氧化碳培养,怎样处理?

  A:在没有独立培养箱情况下,可选用密闭盖培养瓶,拎紧瓶盖培养。


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