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实验外包:Transwell侵袭实验原理步骤

发布时间:2021-08-19 03:24:56 阅读:15872次 来源:本站

  今天主要介绍常用的细胞侵袭方法:Transwell侵袭实验的原理和步骤方法。和细胞划痕实验相比Transwell实验相对复杂一些,在实验过程中往往会出现各种问题,下面我们就一起来探讨下transwell侵袭实验中需要注意的一些细节!

  首先我们来看下图肿瘤细胞转移的5个主要过程,以便于对肿瘤侵袭和转移有个更加清晰的认识。

肿瘤细胞转移过程

肿瘤细胞转移过程

  其中细胞侵袭便发生在第一步,即肿瘤细胞在原位突破基底膜,然后内渗进入血管、淋巴管的过程,后期才开始进行转移。本期我们就为大家讲述利用transwell小室模拟细胞侵袭的实验方法。

  Transwell侵袭实验的原理和过程

  transwell原理简单来说,将transwell小室放入培养板中,并将高营养液与低营养液用一层膜隔开,细胞放在低营养液中,而为了获更多的营养,细胞则会穿过这层膜,进入高营养液。细胞transwell实验,可作为一种非常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的方法。transwell小室的结构示意图如下左图;

 

  下右图为利用血清为诱导因子,模拟肿瘤细胞侵袭的过程。简单来说即:膜可以将上下室的营养液隔开,如下室常为有血清培养基。这样细胞放无血清的培养基里,为了吃的更好会往下跑,但是有膜挡着,所以要穿过膜才行。此时膜上涂一层基质胶,就可模仿细胞外基质,细胞必须要把基质消化了才可跑到下室,最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

transwell小室结构示意图横机纹肉瘤细胞侵袭示意图

  Transwell侵袭实验的具体步骤

  一、实验材料(提前1天准备)

  a)Transwell小室

  b)基质胶:常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体,在 37℃会逐渐凝固成胶状,且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构,这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了;

  c)上层培养液:上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,可以加入0.05%-0.2%BSA;

  d)下层培养液:下层培养液采用含5%-10%FBS的培养基,具体浓度根据细胞转移力而定,转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移,如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子;

  e)细胞培养板:常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中,以24孔板最常用,下面就以24孔板为例。

  二、操作步骤

  1.铺基质胶:在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1:8比例稀释(其稀释比例需要摸索,选择一个细胞穿过适中的浓度即可),取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面,37℃放置0.5-1h,使其聚合成凝胶;

  Tips:

  a) 将枪头沿小室内壁将Matrigel轻轻打出,切忌戳到小室滤膜;

  b) 加入的Matrigel胶的体积不可太大,把聚碳酸酯膜浸湿即可;

  c) 注意低温,枪头、小室等都应该4℃预冷。

  2.细胞培养:取对数生长期的待测细胞,并用PBS洗涤,接着用无血清培养基悬浮细胞,调整细胞密度为1-10*105/ml;

  3.接种细胞:在24孔板下室一般加入500-650 μL 含 5%-10%FBS 或趋化因子的培养基,然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内,取细胞悬液100-200μL 加入上室,最后放入培养箱中培养12-48h(根据癌细胞的转移能力而定)。

  Tips:

  a) 尽量避免气泡的产生:下层培养液和小室间常会有气泡产生,会影响下层培养液的趋化作用。因此一旦出现大气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板;

  b) 注意细胞一定要接种均匀,建议沿着壁缓慢加入;

  c) 时间点的选择除了要考虑到细胞的转移能力以外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视,如某些药物会抑制细胞的增殖。

  4.细胞固定:取出小室,吸走培养基,用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL,将小室放入后固定20-30min。

  5.细胞染色及计数:弃固定液,用0.1-%0.2%结晶紫染色5-10min,PBS洗3遍,除去未与细胞结合的结晶紫,用棉签轻轻擦拭小室的上侧,将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉,以便后续镜检。适当风干后,在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。


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