线粒体是真核细胞的能量中心，广泛参与许多细胞生物学过程，需要多层质量控制系统来确保其功能正常，从而维持细胞和有机体的稳态。那么关于线粒体稳态有什么课题设计思路呢？今天我们一起来探讨一下。

接下来我们将分享一篇发表于中科院1区期刊developmental cell，影响因子为10.7的文献，希望能给大家带来不一样的灵感。

一、文章信息

二、研究背景

①许多人类疾病与线粒体结构异常与能量缺乏、异常分布和自噬转换受损有关。就像金发姑娘和三只熊的故事一样，线粒体需要“恰到好处”，不能太小，也不能太大。

②MitoSafe可防止有害的极端融合，这种融合会损害线粒体外膜和内膜的呼吸功能。在细胞膜外，Parkin、磷酸化Parkin和泛素的PINK1促进Mfn1和Mfn2的蛋白酶体降解。

③在细胞膜内，Oma1切割Opa1并抑制内膜融合。在MitoSafe中，Oma1通过反复、短暂的内膜电位下降（称为闪烁）被激活，而不会失去整个膜电位。

④在高灌注的线粒体中，闪烁的频率大大加快。因此，MitoSafe可以被认为是闪烁功能的关键生物过程。然而，目前尚不清楚延长的线粒体是如何引起闪烁的。

三、技术路线

四、研究结果

1.基于活细胞成像的RNA干扰筛选发现Slc25a3对Drp1-KO细胞的闪烁至关重要

为了探究线粒体闪烁的机制，研究团队根据线粒体蛋白质组（MitoCarta3.0）选择了30个线粒体基因，敲除了30个选定的基因后，进行膜电位检测，结果如图1A~C所示，大约60%~70%的Drp1-KO细胞表现出闪烁，通过细胞闪烁评分选定Ccdc51、Mpv17、Slc25a3和Slc25a40。接着，分别敲除Drp1-KO mef中的候选基因并测定其闪烁频率，图1D显示Slc25a3的敲除可以显著降低Drp1-KO mef中闪烁的频率。随后团队使用CRISPR技术敲除了Drp1-KO mef中的Slc25a3，从图1E可以发现Slc25a3的KO显著降低了Drp1-KO mef中的闪烁频率，然而图1F显示Drp1Slc25a3-KO细胞维持与Drp1-KO mef相似的膜电位。表明Slc25a3不影响线粒体膜电位，而在Drp1-KO细胞线粒体低灌注时促进闪烁的机制中发挥重要作用。

2.Slc25a3对于增强Drp1-KO细胞中Opa1的切割很重要

接着，他们就Slc25a3如何在这一机制中发挥作用进行了深入探索。现有研究证明，细胞膜内Oma1切割Opa1并抑制内膜融合。图2A~B显示Oma1介导的Opa1切割在Drp1-KO细胞中增强。与Drp1-KO MEFs相比，Drp1Slc25a3-KO MEFs中L1和L2的水平显著升高。而Drp1-KO mef中Mfn1和Mfn2水平的降低在Drp1Slc25a3-KO mef中没有恢复。表明Slc25a3对于增强Drp1-KO mef中Opa1长异构体的加工至关重要。此外，两种Drp1受体Mff和Fis1的水平在缺乏Drp1或Slc25a3时不受影响。另一种Drp1受体Mid49在Drp1-ko mef或Drp1Slc25a3-KO mef中升高。

如果Oma1对L1和L2的切割减少，预计它们的切割产物S3和S5的水平可能会降低。然而，图2A~B的Drp1Slc25a3-KO mef中并未表现出这一点。通过诱导Opa1-L2-HA在短时间内的表达，结果如图2C~D，发现Slc25a3的缺失显著降低了Opa1 L2-HA向S5-HA的转化。表明Slc25a3对于Drp1-KO细胞中Opa1的切割至关重要。

3.Slc25a3和Drp1的同时缺失会产生巨粒线粒体和聚集线粒体DNA（mtDNA）

此外，在图3A~3C中，团队观察到在Drp1-KO mef中，线粒体被拉长并形成球形结构。在Slc25a3-KO mef中，线粒体形态正常。且与Drp1-KO mef相比，Drp1Slc25a3-KO mef中球形线粒体的频率和大小都显著增加。虽然在光镜下，Slc25a3-KO MEFs的线粒体形态似乎没有受到影响，但图3D电镜结果显示，线粒体的线粒体超微结构发生了显著变化。在Slc25a3-KO mef中，内膜嵴大量缺失，仅发现短而罕见的嵴结构。在Drp1-KO mef中，延长的线粒体维持了正常的嵴结构。这些结构缺陷在单ko mef中被合并到双ko mef中。在Drp1Slc25a3-KO mef中，发现线粒体伸长和增大，但没有大部分嵴。

明确了Slc25a3和Drp1对线粒体形态的影响后，团队进一步探索了其对mtDNA的作用，团队先使用mitotracker检测mtDNA，发现在WT和Slc25a3-KO mef中，mtDNA信号沿线粒体小管存在。如图4A~C所示，在Drp1Slc25a3-KO mef中，线粒体管状部分的mtDNA信号几乎完全丢失，大部分mtDNA聚集在线粒体增大的球形部分。图4D显示，这些数据表明Drp1和Slc25a3协同维持mtDNA的分布。接着使用携带mUNG1（Y147A）突变的质粒转染细胞消除mtDNA。图4E~4J能看到mtDNA的缺失显著降低了Drp1-KO和Drp1Slc25a3-KO MEFs中含有球形线粒体的细胞百分比和球形线粒体的大小。而据图4K所示，闪烁频率不受mtDNA去除的影响。综上，mtDNA的聚集有助于Drp1-KO和Drp1Slc25a3-KO细胞线粒体大小的增加，但不是闪烁，可能是通过物理堵塞和膨胀的线粒体小管。

4.Drp1和Slc25a3缺失对氧化磷酸化和糖酵解的影响

为了探究Drp1和Slc25a3缺失对线粒体功能的影响，他们对细胞耗氧率（ocr）和胞外酸化率（ecar）进行了测定，结果如图5A~B所示，Drp1或Slc25a3的个体缺失降低了ocr，它们的同时缺失进一步降低了基础和最高水平的ocr。这些叠加效应表明Drp1和Slc25a3在线粒体呼吸中的作用是不同的。在图5C~D中，与ocr相比，Drp1-KO、Slc25a3KO和Drp1Slc25a3-KO MEFs的基础ecar增加。然而在图5D中能看到三组所有细胞的糖酵解储备减少，但糖酵解能力没有明显变化。综上，Drp1和Slc25a3缺失影响氧化磷酸化和糖酵解。

5.slc25a3介导的铜转运对Drp1-KO细胞的闪烁、Opa1加工和线粒体形态至关重要

最近的研究表明，Slc25a3除了运输磷酸盐外，还运输铜。在Slc25a3中引入了阻止铜和磷酸盐H75A或特异性磷酸盐的L175A突变。如图5E显示，Slc25a3（H75A）在铜和磷酸盐的运输中都有缺陷，但未能挽救Drp1Slc25a3-KO mef中减少的闪烁。相比之下，图5E中的Slc25a3 （L175A）在Drp1Slc25a3-KO mef中仅存在磷酸盐运输缺陷，其闪烁频率显著增加，与WT相似。而在图5F中，Cu-ATSM处理有效地增加了Drp1Slc25a3-KO mef的闪烁率。同样的，图5G的原子吸收光谱证实，铜转运到线粒体的减少降低了Drp1Slc25a3-KO mef的闪烁率。

在图5H~I中能看到WT和Slc25a3（L175A）恢复了Drp1Slc25a3-KO MEFs中的Opa1加工并降低了L1和L2水平，然而不能恢复Drp1Slc25a3-KO MEFs中Mfn1和Mfn2的降低。综上，Slc25a3转运铜在Drp1-KO细胞的闪烁和Opa1加工中起着至关重要的作用。

此外，在图6D中能看到L175A突变体挽救了Slc25a3-KO细胞的嵴结构，而H75A突变体则没有。图6E~6G中的L175A突变体完全恢复了Slc25a3-KO细胞的基础和最大ocr，而H75A突变体没有恢复基础ocr，只是部分增加了最大ocr。综上，Slc25a3的铜转运活性对维持嵴结构和线粒体呼吸至关重要。

6.铜结合酶SOD1和COX以相反的方式控制闪烁

人类Slc25a3缺陷导致致命的线粒体缺陷，并伴有乳酸酸中毒、肥厚性心肌病和新生儿张力低下的症状。在第一个跨膜a-螺旋中引入了疾病相关的G72E突变。能在图7J~K中看到，WT人Slc25a3在Drp1Slc25a3-KO mef中挽救了Opa1的切割，而Slc25a3（G72E）没有，尽管它们的表达水平相似。而图7L的分离线粒体的原子吸收光谱分析显示，Slc25a3（G72E）不能补充Drp1Slc25a3-KO MEFs中的线粒体铜水平。总之，致病性G72E突变损害了人类Slc25a3的铜转运活性，从而影响了其在维持线粒体结构和功能中的关键作用。

五、研究小结

本研究揭示了线粒体铜由Slc25a3转运，在线粒体高灌注时通过抑制融合来调节线粒体融合与分裂的平衡。首先作者通过基因筛选发现Slc25a3缺失显著降低Drp1KO细胞的闪烁频率；并进一步证实了Slc25a3铜转运在Drp1-KO细胞的闪烁和Opa1加工中起着至关重要的作用，以及Drp1缺失的情况下，Slc25a3铜转运对线粒体形态和能量代谢以及mtDNA分布的影响；同时还揭示了铜转运控制闪烁的机制。最后得出结论：线粒体铜由Slc25a3转运，在线粒体高灌注时通过抑制融合来调节线粒体融合与分裂的平衡。铜的这种功能是由两种含铜酶介导的：铜依赖酶SOD1抑制闪烁，COX促进闪烁来影响闪烁。

六、国自然中标情况