贴壁细胞和悬浮细胞免疫荧光染色方法步骤（以间接免疫荧光法为例）

　　1细胞准备与固定

　　（1）单层生长细胞：取对数生长细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置几张6×22mm盖玻片的培养瓶或培养皿中，置二氧化碳培养箱培养1-3天，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，进入PBS（0.01mol/L,pH7.4）洗2次，然后根据实验目的，选择适当固定剂固定细胞。常用固定剂有：95％乙醇（固定时间10-30min），丙酮（5－10min）等。

　　（2)悬浮生长细胞：取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，或用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入95％乙醇或丙酮中固定。

　　2、将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。

　　3、滴加适当稀释的特异性抗体，置于湿盒内，37度保温30－60min或度冰箱过夜

　　4、PBS振洗3次，每次5min，吹干。

　　5、滴加适当稀释的荧光素标记抗体，置于湿盒内，37度保温30－60min。

　　6、PBS振洗2次，每次5min，然后用蒸馏水振洗1次。

　　7、50％缓冲甘油封片。

　　【结果】

　　在荧光显微镜下观察，阳性部位出现荧光，依荧光素种类不同呈现不同颜色的荧光，入FITC呈现黄绿色荧光，罗丹明B200呈现橙红色荧光。

　　标本染色反应后应及时观察并照相。若无时间立即观察标本，可把标本放入4度冰箱保存。但应注意，过夜后特异性荧光减弱30％，一周后则减弱50％。如果用聚乙-烯醇封片，可保存较长时间。