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细胞实验:原代细胞鉴定技术操作步骤

2023-03-27 10:38:34
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  动物组织是由多种类型的细胞组成的,包括表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。分离出的细胞是否是实验所需类型的细胞则需要进行鉴定,除了基本的形态学观察外常用的就是免疫组织化学检测。

  原代细胞鉴定技术操作步骤:

  1. 将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中,将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片,待细胞长至80%时取出爬片。

  2. 用PBS浸洗爬片3次,4%的多聚甲醛固定爬片15min,再次用PBS浸洗玻片3次,每次3min。

  3. 0.5% Triton X-100(PBS配制)室温孵育爬片20min,使细胞通透。

  4. 3% H2O2滴加爬片上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育15min(一般用甲醇或蒸馏水稀释30%过氧化氢),PBS冲洗3次,每次3min。

  5. 封闭血清室温孵育20min,PBS冲洗3次,每次3min。

  6. 细胞特异性一抗孵育:按照抗体说明书稀释比例稀释好一抗,滴加在爬片上,于4°C湿盒中孵育隔夜,PBS冲洗3次,每次3min。

  7. 二抗孵育:选与一抗对应的二抗,按比例稀释后滴加在爬片上,37°C湿盒中孵育30min,PBS冲洗3次,每次3min。

  8. 将爬片周围水渍吸干,爬片上滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下观察,当出现棕黄色或棕褐色的阳性信号时用蒸馏水冲洗终止显色。

  9. 复染:用Harris苏木素复染30s~1min,水洗后用1%的盐酸酒精分化,再用蒸馏水(或PBS)水洗返蓝。

  10. 封片:将中性树胶滴在爬片一侧,再用盖玻片盖上,先放平盖玻片一侧再轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好的爬片平放置于通风厨中晾干。

  11. 镜检观察。


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