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使用PCR检测试剂盒要注意哪些事项

2023-03-07 10:42:57
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  PCR检测试剂盒原则:

  ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

  ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

  ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

  ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

  ⑤引物3'端的碱基,特别是末及倒数NO.2个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

  ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

  ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

  ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

  ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

  ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

  ⑤引物3'端的碱基,特别是末及倒数NO.2个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

  ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

  ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性

  PCR检测试剂盒注意事项:

  ①加入试剂的顺序应*,以保证所有反应板孔温育的时间一样。

  ②使用干净的塑料容器配置洗涤液。

  ③按照鸡血红蛋白(HB)elISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

  ④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。

  ⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

  ⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器 。

  ⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。

  ⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。

  ⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

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