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qPCR实验结果分析基本步骤(3个步骤)

2022-12-22 10:36:01
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  实时荧光定量PCR实验会产生大量实验数据,一般可以用PCR仪自带的软件进行收集、分析。但即使有了方便可靠的软件,我们也需要对原始数据进行检查、再分析,评估数据的质量和可靠性。

  这需要三个基本的步骤。

  第一步,查看扩增曲线,有必要时调整基线和阈值。

图例

  Ct值由基线和阈值计算得来,所以他们的值对结果影响很大。软件会给出1个默认的基线和阈值,但不一定是最合适的,需要我们进行手动调整。

  首先进行基线的调整。

  一般范围是循环数3~15,使得靶基因的扩增信号大于背景噪声。出现不正常的扩增曲线,通常是因为设置了不正常的基线,需要对单个孔进行设置。

  比较好的做法是,基线的最小值(起始循环数)设置在背景噪声的尾巴后,最大值(结束循环数)设置为扩增起始点。

  循环范围在5个循环就可以,具体跟扩增曲线的对数图来设定。

  扩增曲线的对数图是什么?

  阈值,我们在操作软件时上下拉动的横线,是决定Ct值的因素之一。

  阈值是荧光信号相对于基线有显著增强的点,大多数仪器会根据基线平均信号,自动计算荧光信号的阈值水平,并设置一个比平均值高10倍的阈值。

  也就是说,当基线被正确的设置了,阈值也能手动调整成正确值。

图例

  需要注意的是:

  1、读取阈值相关的分析数据时,不能随意改变阈值的设置。只有分析不同样本,或相同样本不同靶基因时,才能调整阈值。

  2、设置阈值线时,要在扩增曲线的指数扩增区域内设置,不能在起始阶段,也不能在荧光背景(基线)区域。

  3、每次改变阈值时,要查看标准曲线的斜率和R的平方有没有改善。没有使用标准曲线时,也可以计算3个复孔(相同条件扩增的样本)的标准偏差。好的阈值应该要改善Ct值的表现。

  未经处理的扩增曲线对数图如下。

  以下情况,基线不需要调节:

图例

  1、样本扩增曲线刚好在基线最大值的地方开始。

  2、浓度最高的样本,即扩增曲线最快进入指数期的,Ct值小于15(基数上限)。

  以下情况,基线需要调节:

  1、最高浓度样本的扩增曲线,起始点在基线最大值前面,表明基线太高。可以将基线结束值调小1~2个循环。

图例

  2、最高浓度样本的扩增曲线,起始点距离基线最大值太远,表明基线太低。可以将基线结束值调大1~2个循环数。

图例

  这两种情况,扩增曲线对数图均会出现“破坏断裂",即图中红色圈住的地方。

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