实时荧光定量PCR实验会产生大量实验数据，一般可以用PCR仪自带的软件进行收集、分析。但即使有了方便可靠的软件，我们也需要对原始数据进行检查、再分析，评估数据的质量和可靠性。

　　这需要三个基本的步骤。

　　第一步，查看扩增曲线，有必要时调整基线和阈值。

　　Ct值由基线和阈值计算得来，所以他们的值对结果影响很大。软件会给出1个默认的基线和阈值，但不一定是最合适的，需要我们进行手动调整。

　　首先进行基线的调整。

　　一般范围是循环数3～15，使得靶基因的扩增信号大于背景噪声。出现不正常的扩增曲线，通常是因为设置了不正常的基线，需要对单个孔进行设置。

　　比较好的做法是，基线的最小值（起始循环数）设置在背景噪声的尾巴后，最大值（结束循环数）设置为扩增起始点。

　　循环范围在5个循环就可以，具体跟扩增曲线的对数图来设定。

　　扩增曲线的对数图是什么？

　　阈值，我们在操作软件时上下拉动的横线，是决定Ct值的因素之一。

　　阈值是荧光信号相对于基线有显著增强的点，大多数仪器会根据基线平均信号，自动计算荧光信号的阈值水平，并设置一个比平均值高10倍的阈值。

　　也就是说，当基线被正确的设置了，阈值也能手动调整成正确值。

　　需要注意的是：

　　1、读取阈值相关的分析数据时，不能随意改变阈值的设置。只有分析不同样本，或相同样本不同靶基因时，才能调整阈值。

　　2、设置阈值线时，要在扩增曲线的指数扩增区域内设置，不能在起始阶段，也不能在荧光背景（基线）区域。

　　3、每次改变阈值时，要查看标准曲线的斜率和R的平方有没有改善。没有使用标准曲线时，也可以计算3个复孔（相同条件扩增的样本）的标准偏差。好的阈值应该要改善Ct值的表现。

　　未经处理的扩增曲线对数图如下。

　　以下情况，基线不需要调节：

　　1、样本扩增曲线刚好在基线最大值的地方开始。

　　2、浓度最高的样本，即扩增曲线最快进入指数期的，Ct值小于15（基数上限）。

　　以下情况，基线需要调节：

　　1、最高浓度样本的扩增曲线，起始点在基线最大值前面，表明基线太高。可以将基线结束值调小1～2个循环。

　　2、最高浓度样本的扩增曲线，起始点距离基线最大值太远，表明基线太低。可以将基线结束值调大1～2个循环数。

　　这两种情况，扩增曲线对数图均会出现“破坏断裂"，即图中红色圈住的地方。