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细胞培养中成团了怎么处理

2022-12-21 10:37:32
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  细胞抱团一定代表细胞状态不好吗?

  细胞生长的时候肯定是要相互联系,大部分的细胞都是要成片生长的,应该仔细观察每种细胞的状态,抱团并不一定代表不好:

  1. 若细胞轮廓清晰,可看清楚一个个的细胞,像葡萄一样,一串串的,是状态好的,说明细胞在分裂。

  2. 但大部分细胞抱团绝对不是一件好事!如果轮廓消失,出现细胞融解或细胞变灰暗、透光性变差,就是细胞死亡了。葡萄状和抱团,在镜下其实很容易区别。抱团死亡的细胞可以看到细胞碎片

  细胞成团的原因

  1、消化的过程过于粗暴,吹打太用力,消化过久,消化液太强或有毒性等会导致细胞死亡。细胞死亡后会释放出DNA,缠绕其他细胞,形成黏性的细胞团。

  2、细胞离心速度过大或时间太长,也容易造成细胞抱团。

  3、消化不完全的时候,细胞和细胞之间的连接没有分开;消化过度的时候,圆形的细胞容易聚堆,再分开很困难。

  4、状态不好、老化的细胞,也可能会出现抱团生长的情况(比如换液不及时、长得太满才传代、污染等造成的细胞状态差)。

  5、传代时没有吹打均匀,细胞团多,培养时就会是一团一团的。

  6、传代后细胞铺板不均匀。

  7、有可能是杂细胞,或者死细胞。

  8、接种不均匀,或者是细胞未消化开。

  9、非震荡培养或细菌(胞)量过多的话就会成团。

  如何避免细胞成团?

  首先确认当前细胞生长密度及状态,80%左右的生长密度即可进行传代,此时细胞状态较好,且用于传代的数量也足够。

  传代操作前,使用缓冲液对细胞进行适当且全面地润洗,清除死亡的细胞团和部分堆叠杂质(在选择适当胰酶浓度时,对于不同代数的不同细胞系需进行一定的调整,如:部分贴壁牢固的细胞应将胰酶分装后,进行预热处理;细胞密度过高时,应该向胰酶中加入少量缓冲液,缓慢均匀地消化细胞等。对于贴壁格外牢固的细胞,可以尝试多次分批进行消化,最大限度保证细胞状态)。

  在消化过程中,需均匀慢速晃动培养器皿,以免局部胰酶浓度过高而影响传代。切勿用力摇动,导致边缘松动的大片细胞直接脱落,从而增加细胞成团几率。培养器皿的选择也需注意,部分实验室会使用玻璃培养瓶,因细胞贴壁在玻璃底更容易分离。同时玻璃材质的亲水性和塑料有区别,而且玻璃细胞培养瓶都是实验室内部处理,可能会有清洁残留,在一定程度上抑制细胞的贴壁生长,并且更容易消化,细胞之间的连接比贴壁还要紧密,聚团几率很大。

  另外,避免传代过程中汇合度较大,本身1:3甚至1:4都可以正常培养的细胞被1:2传代,会导致母代细胞浓度过高,在分化过程中出现堆叠现象

  适当的处理和设备使用,也可以减少成团。如果使用离心机分离或混合样品,将其设置为正确的速度可以减少聚团,通常情况下,较快的速度可以离心散细胞,但在高速下也必须考虑细胞的脆弱性。

  细胞抱团了,要如何处理?

  1. 如果细胞抱团不影响生长就没问题,只是计数时较麻烦。在消化时,可在细胞由多角形变成圆型之前,用手轻磕培养瓶的侧壁,使细胞从壁上脱落(最好不要吹打,对细胞形状和生长都不好)。

  2. 如果感觉有死细胞的DNA,在细胞悬液中加入几滴无菌的DNAse(1mg/ml溶于水)将DNA链打断。轻柔地吹打细胞,防止对细胞膜造成物理损伤。

  3. 如果细胞抱团是肉眼可见的,可让细胞静置半分钟左右,然后吸取上半部分没有抱团的细胞悬液来传代。如果细胞抱团肉眼不可见,目前还没有特别好的分离方法,只能等细胞状态改善后将这部分细胞慢慢排除出去。

  总结

  引起细胞抱团的根本原因是细胞状态变差,且在吹打细胞的时候,那些状态好的细胞也会因为多次吹打而受损,所以我们认为最根本的解决方法是摸透培养的细胞的生长习性,让细胞保持较好的生长状态。


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