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凋亡晚期检测方法(两种方法)

2022-12-16 10:31:26
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  细胞凋亡晚期中,核酸内切酶(某些Caspase的底物)在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法:

  1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

  通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP (多为dUTP)间接(通过地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法,直接荧光标记,地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色,可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中,直接标记步骤少,操作简便。而间接标记有信号放大的作用,检测灵敏度高。

  2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

  当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少(如活体组织切片)时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR(ligation-mediated PCR),连上特异性接头,专一性地扩增核小体的梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

  上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤(如机械损伤,紫外线等)也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

  3) Telemerase Detection (端粒酶检测)

  这是相对来说推出较早,用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物,分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同个数的6碱基(GGTTAG)端粒重复序列,通过PCR反应,产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象(参见图4)。此外,Intergen公司还提供用酶联免疫法(ELISA)检测的试剂盒.

  同样,这种检测方法也不专对细胞凋亡,检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。


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