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免疫细胞分离方法详解

2022-12-03 10:17:34
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  免疫细胞(immune cell)俗称白细胞,包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等,也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分,在体内分布很广泛。除淋巴细胞外,参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞。

  免疫细胞分离方法:

  1、根据细胞属性(如粘附)和功能不同进行细胞分离:粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等。

  2、根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离:葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll 不连续密度梯度离心法等。

  3、利用细胞表面标志进行细胞分离:E 花环沉淀分离技术、免疫磁珠法分离、流式细胞术分离法、补体细胞毒分离法,洗淘分离法(panning)

  其中外周血单个核细胞的分离和免疫磁珠分离细胞是最常见的免疫细胞分离方法。

  外周血单个核细胞的分离

  【原理】

  外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离 PBMC 的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法。用此方法分离 PBMC 纯度可达95%,淋巴细胞约占 90%,其中 T 淋巴细胞占 80%,B 淋巴细胞占 4~10%。下图红色方框内即为PBMC。

图例

  【方法】

图例

  【注意事项】

  1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时,上述操作过程都要在无菌条件下进行,所用器材、试剂都应为无菌。

  2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光 4℃保存。

  3、不同属的PBMC所需的分离液都不同,在分离人 PBMC 时,要求其比重为 1.077;分离小鼠单个核细胞时比重为 1.080;分离大鼠单个核细胞时比重为 1.084~1.087;分离马单个核细胞时比重为 1.090。

  4、往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时,不得将血液冲入分离液中,须保持两层液体的清晰界面。

  免疫磁珠法分离淋巴细胞

  【原理】

  免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。免疫磁珠法分离细胞可分为直接法和间接法。

图例

  【方法】

  根据磁珠结合的细胞与所要获得的细胞的关系,免疫磁珠法分离细胞可分为正选法和负选法。正选法即磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞,负选法即磁珠结合不需要的细胞,游离于上清液的细胞为所需细胞。还有一种基于负选法的高效分离方法,即在实验体系中加入连接有磁珠的多种单抗,通过磁性分离器后,则所有不需要的细胞被吸附在磁架上,未被吸附的细胞为目的细胞。这种方法可一次去除多种细胞,又称鸡尾酒法(cocktail)。

图例

  【特点】

  1、纯度高:所获细胞纯度达(93%-99%)。

  2、得率大:获率可达90%。

  3、对细胞活影响小:活细胞率大于95%。

  4、操作简单:不需使用离心沉淀分离技术。

  5、省时且费用低:不需要昂贵仪器。

  【测试结果】

图例

图1 山羊抗小鼠IgG免疫磁珠分选CD4+淋巴细胞流式检测图


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