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RAW264.7培养注意事项和要点

发布时间:2022-06-17 10:29:45 阅读:16572次 来源:百度学术

  巨噬细胞属免疫细胞,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象,RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)就是科学实验中常用到的细胞系,其来源为雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。RAW264.7培养有许多注意事项,在培养过程中容易出现细胞形态改变(长出伪足)、消化困难、生长缓慢等问题。由于细胞的生长状态对实验数据是存在较大影响的,所以今天就来和大家分享一下RAW264.7细胞培养的经验。

  一、细胞的形态与特点

  RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形,小而透亮。因为其具有较强的吞噬能力,并在吞噬抗原后释放趋化因子,促使细胞分化出伪足,粘附攀爬能力也因此增强。若细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣就会促使细胞呈现出梭形、长梭形,镜下观察就会发现细胞形态变为梭形且面积变大,不再是具有细长伪足的类圆形小细胞。这也是出现消化困难的一个主要原因。

  二、培养注意事项和要点

  1. 由于RAW264.7细胞易有不同形态,传代时就会发现形态变为梭形的细胞很难消化下来,轻敲培养皿细胞不会脱落,用力吹打又容易对细胞产生较大损伤,因此要尽量避免细胞发生形态改变。即在接种细胞时保持一个适中的传代密度,避免其向终末细胞分化,因为一旦细胞发生分化变为长形是无法恢复的,这是培养RAW264.7细胞时最需要注意的问题。

  2. RAW264.7细胞喜欢连片生长,正常状态下应该是一小片一小片的分布在培养皿中,片片之间不相连接,等到长到更多更密的时才会连成大片,但同时也会叠加成层,容易出现部分细胞飘起无法贴壁的问题。所以,要关注好细胞的汇合程度,控制好细胞的生长速度,不能等到叠加成层时才去传代。

  3. RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短,半小时左右绝大部分细胞就能够贴下去,刚贴壁时细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于培养皿中。生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类的。这个时候就是在提醒你注意传代了,此时无论汇合度如何都需要进行传代了,因为形态发生改变的细胞对实验结果会产生较大影响,最终造成实验数据不理想。

  4. 在细胞生长的初始阶段,细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加,细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。细胞密度达到一定的程度,会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中,镜下观察会同时出现悬浮和贴壁两种形态。

  5. 该细胞传代时不需要用胰酶消化。传代时,吸走部分培养液,留下少许培养液(例如使用T25培养瓶留下2 ml),用无菌细胞刮刮拭培养表面将细胞刮落,充分吹打后接种到新的装有新鲜培养液的培养瓶内,混匀后进行培养。

  6. 该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或者立方形。当细胞密度较大时,细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一起,有些细胞甚至脱落漂浮。这些漂浮的细胞是存活的,在传代时应收集起来,离心后细胞沉淀可以继续培养。

  7. 血清质量差异可能引起细胞贴壁能力变化,建议选用高质量的胎牛血清。

  三、复苏、培养、传代和冻存

  复苏:从液氮罐中取出细胞转移至-80℃冰箱平衡温度,准备15mL离心管根据需求加入适量预热过的完全培养基(细胞冻存悬液:完全培养基=1:6),37℃水浴锅孵育,复温后吸出细胞悬液至15ml离心管,离心去除冻存上清后,根据细胞量用新鲜培液重悬,转移至合适大小的培养皿中培养,第二天换液。

  培养:DMEM-HD+ 10% FBS;5% CO2 ,37.0°C

  传代:去除培养皿中的旧培养基,滴加1×PBS清洗一遍,去除PBS,加胰酶消化,随时观察消化程度,加入完全培养基终止消化(胰酶:完全培养基=1:2),收集细胞悬液离心(一般为1100转,4分钟),去除上清,根据需求确定传代比例(约1:3~1:6传代/3d),用新鲜培养基轻柔吹打重悬,铺回皿中晃匀。

  冻存:无血清冻存液,直接放至在-80℃冰箱,注意受冷要均匀,第二天转入液氮。

  四、具体解决方案

  在培养RAW264.7细胞的过程中容易遇到的问题主要包括以下几种:

  1. 复苏后存活率不高

  2. 细胞形态发生变异

  3. 不同形态细胞消化时间不等

  4. 细胞生长速度缓慢

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1275.html

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